Alfafa

Foto: Rosa Lía Barbieri

Alfafa

Maria Teresa Schifino-Wittmann

A alfafa (Medicago sativa L.), a “rainha das forrageiras”, pertence à família Leguminosae, subfamília Papilionoideae (ou Faboideae).

Originária do atual Irã, a alfafa é uma planta herbácea perene tetraploide (2n=4x=32), cultivada nas regiões temperadas e subtemperadas do mundo. Registros arqueológicos mostram que ela já era utilizada na alimentação animal há muito tempo. A história da alfafa está ligada aos povos criadores de cavalos e aos movimentos dos exércitos conquistadores, que a disseminaram durante as guerras e invasões.

Além de forrageira, tem papel importante na melhoria do solo, em virtude da sua capacidade fixadora de nitrogênio por simbiose com Rhizobium meliloti. Também é utilizada para diversos outros fins, até mesmo na alimentação humana. Uma espécie relacionada – M. truncatula Gaertn. – está sendo objeto de mapeamento genômico, que já se encontra em fase bastante adiantada.

Neste capítulo, será apresentada a importância econômica da alfafa, bem como sua taxonomia, origem, evolução e aspectos gerais de seu melhoramento e de espécies relacionadas.

Importância econômica

A alfafa é uma planta forrageira, herbácea, perene, extensivamente cultivada nas regiões temperadas e tropicais secas do mundo, utilizada como feno, pastagem e silagem. Mais do que qualquer outra cultura forrageira adaptada a essas regiões, a alfafa combina alta produção de biomassa, perfis nutricionais ótimos e sobrevivência adequada, o que torna seu cultivo ideal para gado de leite e corte. No contexto de um sistema de culturas, controla a erosão do solo, aumenta a qualidade da água, diminui as epidemias de pragas e doenças que atacam as plantas e contribui significativamente para a quantidade de nitrogênio disponível para as culturas sucessoras. Para ser lucrativa, a alfafa deve sustentar altas produções por um período de vários anos (BRUMMER, 2004), e essa sobrevivência depende do estabelecimento de um profundo sistema de raízes, que também confere um alto grau de resistência à seca. Seus brotos surgem de gemas da coroa e a produção de forragem pode ser aumentada por brotos axilares (LANGER, 1995).

É uma planta glabra, com folhas trifolioladas, folíolo central levemente elevado e pecíolo curto. Os folíolos são ovoides, serrilhados na margem superior, com nervura saliente. Uma planta de alfafa pode chegar a ter de 5 a 25 ramos com até 60 cm a 90 cm de altura (BARNES; SHEAFFER, 1985). As flores, papilionáceas típicas, com 10 estames compactados dentro das pétalas da quilha, são púrpura-azuladas e ficam dispostas em racemos axilares. Para haver polinização, deve ocorrer estímulo mecânico (tripping). Nesse processo, a coluna estaminal é projetada com violência, atingindo o inseto polinizador. Por isso, a abelha doméstica, Apis mellifera, não é um polinizador muito eficiente, a não ser que seja utilizada uma alta densidade de colmeias. Mais confiáveis, apesar de não controláveis, são as abelhas do gênero Bombus (bumble-bees). Em condições ensolaradas e de climas amenos, Megachille rotundata (leaf cutter bee) é a melhor polinizadora da alfafa. Em alguns locais, essa espécie já é, até mesmo, domesticada e amplamente empregada (LANGER, 1995). As vagens são enroladas em cerca de duas a cinco voltas. As sementes são geralmente riniformes, com tamanho que varia de 1 mm a 2 mm (TEUBER; BRICK, 1988). A alfafa é normalmente alógama, mas pode haver uma certa taxa de autofecundação (BARNES; SHEAFFER, 1985; LANGER, 1995). O mecanismo de autoincompatibilidade presente em alfafa, o qual aparentemente reside em interações entre o tubo polínico e o óvulo, dentro da cavidade ovariana, é apenas parcialmente efetivo para evitar a autofertilização (VIANDS et al., 1988).

Mesmo agora, no início do terceiro milênio, a alfafa – cultura extremamente benéfica e versátil – continua a ser uma das principais forrageiras do mundo, sendo essa sua utilização preponderante (RUSSELLE, 2001). Apesar de os fertilizantes nitrogenados e as tecnologias de controle de pragas e doenças terem reduzido a necessidade de rotação de culturas que incluem leguminosas perenes, a alfafa continua sendo importante para a melhoria do solo, além de ser uma das principais fontes de alimento utilizada para os animais. Além disso, ela também tem outros papéis, como eliminar alguns poluentes. Os brotos de alfafa, bastante utilizados na alimentação humana, têm alta atividade antioxidante e concentração de fitoestrógenos. As folhas são fonte de vitaminas A, E e K, e têm quatro vezes mais vitamina C que sucos cítricos. Também há linhas que produzem fitases, e as fibras das plantas podem ser usadas na manufatura de papel (RUSSELLE, 2001).

Cerca de 55% da área cultivada com alfafa no mundo (32,4 milhões de hectares) concentra-se nos Estados Unidos (8,9 milhões de hectares), no Canadá, na Argentina (7,3 milhões de hectares) e na antiga União Soviética (LANGER, 1995; RUSELLE, 2001). Nos Estados Unidos, a importância da alfafa reflete-se até em nomes de localidades, como o Alfalfa County, em Oklahoma, e a cidade de Lucerne (nome utilizado na Europa para a alfafa), na Califórnia. É uma importante forrageira em vários países da América Central e da América do Sul, incluindo, além da Argentina, o Peru, o Chile e o Brasil. É encontrada em combinações especiais de solo e de clima no México, na Guatemala e no Equador (RUSSELLE, 2001).

Taxonomia, distribuição geográfica, origem e evolução

O gênero Medicago, considerado monofilético (BENA et al., 1998), compreende mais de 60 espécies, das quais dois terços são anuais e um terço é perene. É endêmico da região do Mediterrâneo, espalhando-se até a Espanha e Ilhas Canárias a leste, China ao oeste, Sibéria ao norte e Iêmen ao sul. O centro primário do gênero é encontrado no Cáucaso, noroeste do Irã e nordeste da Turquia (QUIROS; BAUCHAN, 1988). Supõe-se que sua evolução tenha ocorrido durante o período Terciário, no qual ocorreram diversos eventos geológicos importantes, como a formação de cadeias de montanhas, como os Alpes, os Pirineus, os Apeninos e o Himalaia. Com base na distribuição atual, a costa norte do Mediterrâneo parece ser a área de origem das espécies perenes. Durante essa época, a bacia do Mediterrâneo era quente e desértica em alguns períodos, provendo novos hábitats e favorecendo o surgimento das espécies anuais a partir das perenes (QUIROS; BAUCHAN, 1988).

A alfafa cultivada faz parte do chamado complexo M. sativa-falcata, formado por táxons diploides e tetraploides, tratados por alguns autores como espécies e, por outros, como subespécies, o que é mais aceito atualmente.

Dentro desse complexo, as espécies básicas seriam M. sativa (alfafa cultivada), M. falcata e M. glutinosa ou, como é mais aceito atualmente, M. sativa subsp. sativa (L.) L & L., M. sativa subsp. falcata Arcangeli e M. sativa subsp. glutinosa M.B. Apesar da grande variabilidade morfológica e fisiológica que há entre os diferentes táxons, não existem barreiras evidentes ao fluxo gênico entre as diferentes formas de um mesmo nível de ploidia. Quando os diploides são tetraploidizados, a hibridação com os tetraploides naturais dá origem a híbridos férteis (STANFORD et al., 1972; QUIROS; BAUCHAN, 1988). Apesar de algumas diferenças morfológicas, M. sativa ssp. falcata e M. sativa ssp. coerulea Schmalh. pertencem à mesma espécie biológica, como demonstrado por análises genéticas e citogenéticas (MCCOY; BINGHAM, 1991); portanto, a denominação de subespécies é mais pertinente.

Formas diploides e tetraploides (mais raras) de M. sativa ssp. falcata (perene, flor amarela, vagens em geral retas ou em forma de foice) estão adaptadas a climas frios e ocorrem da Alemanha à Sibéria e da costa do Mar Negro à Bulgária (entre 42° e 62°N). As formas com flores púrpura-azuladas pertencem à silvestre M. sativa ssp. coerulea (anual, diploide, flores púrpura-azuladas, vagens enroladas) ou à cultivada tetraploide M. sativa ssp. sativa. Esta última prefere climas mais amenos. Híbridos entre as duas subespécies ocorrem e são denominados de M. sativa ssp. x varia Martin ou, antes de sua origem ser entendida, como M. media Pers. Na primeira geração, antes da segregação das características, as flores são esverdeadas (LANGER, 1995).

M. glomerata Balb. (perene, diploide, flores amarelas e vagens enroladas) também é relacionada ao complexo M. sativa e supõe-se que tenha sido ancestral das subespécies diploides coerulea e falcata e da tetraploide glutinosa (LANGER, 1995) – Figura 1.

Figura 1

Figura 1. Possível rota evolutiva no complexo M. sativa e espécies próximas, a partir de um ancestral perene.

Fonte: Quiros e Bauchan (1988).

Há muita especulação sobre a diferenciação morfológica das diploides M. sativa ssp. coerulea e M. sativa ssp. falcata. Possivelmente, M. glomerata ocupava anteriormente uma área maior, chegando ao Cáucaso, onde serviu de provável ancestral a duas subespécies do complexo, por separação espacial da população original. A população mais ao sul, ssp. coerulea, por pressões de seleção impostas pela competição por polinizadores, teria sofrido perda de carotenoides e antocianinas nas flores. A população ao norte, ssp. falcata, teria sofrido pressões de seleção para vagens retas, facilitando a dispersão das sementes (QUIROS; BAUCHAN, 1988).

A subespécie M. sativa ssp. coerulea é considerada como progenitor da alfafa cultivada, que teria se originado dessa diploide por meio da união de gametas não reduzidos (PFEIFFER; BINGHAM, 1983; MCCOY; BINGHAM, 1988), os quais deram origem a indivíduos altamente heterozigotos e agressivos o bastante para colonizar novos hábitats e ultrapassar a zona de distribuição dos diploides (QUIROS; BAUCHAN, 1988) – Figura 1. A distribuição tanto de M. sativa ssp. coerulea como de M. sativa ssp. sativa, ambas adaptadas a climas temperados, abrange um extenso território, incluindo a região do Mediterrâneo, o Oriente Próximo e o Médio, o Cáucaso e a Ásia Central, a Ásia Média e a Ásia do Sul (QUIROS; BAUCHAN, 1988).

Muitas das relações entre espécies de formas de Medicago foram examinadas considerando características morfológicas, bioquímicas e de cruzamentos (QUIROS; BAUCHAN, 1988). Análises filogenéticas no gênero têm sido feitas principalmente com as espécies anuais (BRUMMER et al., 1995; MARIANI et al., 1996; BENA et al., 1998).

Anteriormente, havia discordância sobre a origem alo ou autopoliploide da alfafa, o que se refletiria no tipo de herança: dissômica ou tetrassômica. Uma das razões que contrariava a origem autotetraploide era a frequência muito baixa de quadrivalentes, os quais normalmente seriam esperados em autotetraploides recentes. A observação de bivalentes nos haploides, mostrando haver homologia entre os cromossomos mesmo nesse nível, demonstrou a estrutura autopoliploide da alfafa (BINGHAM; GILLIES, 1971). A herança tetrassômica foi provada pela primeira vez por Stanford (1951), para um fator para flor púrpura, e demonstrado, posteriormente, para diversas outras características, como o controle genético de várias isoenzimas (QUIROS, 1982; CORTS; MARTINEZ, 2000) e os marcadores SSR (Simple Sequence Repeats) e AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) (JULIER et al., 2003). Atualmente, sabe-se que, mesmo em autotetraploides recentes, há uma tendência a uma rápida regularização do pareamento cromossômico (RAMSEY; SCHEMSKE, 2002). Portanto, a formação de quadrivalentes não é um critério que permita a distinção estabelecida entre autopoliploides e alopoliploides.

O fluxo gênico entre populações silvestres e cultivadas de alfafa é comum, e é possível que a hibridação de M. sativa ssp. sativa e M. sativa ssp. falcata tenha contribuído para o cultivo da alfafa ao longo de grande parte da zona temperada (QUIROS; BAUCHAN, 1988).

Jenczewski et al. (1999a, b), utilizando RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) e alozimas, observaram fluxo gênico entre populações naturais e cultivadas de M. sativa da Espanha, mas verificaram que havia mecanismos opostos impedindo a manutenção das características cultivadas nas populações naturais, apesar da distribuição parapátrica dos dois tipos de populações.

Muller et al. (2001) estudaram a diversidade de DNA mitocondrial para entender a dinâmica do complexo de populações silvestre-cultivadas de M. sativa na Espanha. Observaram sete mitótipos (perfis diferentes de DNA mitocondrial), dos quais dois são específicos das populações naturais, mostrando que a forma selvagem de M. sativa na Espanha representa um pool gênico original em relação à cultivada. A presença de outros mitótipos, comuns a ambas as populações, mostra que há fluxo gênico das cultivadas para as silvestres. Muller et al. (2003), utilizando RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) de DNA mitocondrial, verificaram que as populações espanholas naturais de alfafa são um pool gênico endêmico com introgressão parcial da cultivada. Prosperi et al. (2006), por meio de análise multivariada para diversos caracteres quantitativos, identificaram populações híbridas entre formas cultivadas e silvestres.

Citogenética

O número cromossômico básico do gênero Medicago é x=8. A maioria das espécies é diploide com 2n=2x=16, com exceção das espécies anuais M. constricta Dur., M. praecox DC., M. polymorpha L., e M. rigidula (L). All., todas com 2n=2x=14, e M. murex Willd., que apresenta 2n=14 e 2n=16, indicando ocorrência de disploidia durante a evolução. O nível tetraploide (2n=4x=32) é verificado tanto na alfafa cultivada, quanto em M. glutinosa, M. arborea L., M. dzhawakhetica Bordz. e M. schischkinii Sumn. Raças diploides (2n=2x=16) e tetraploides (2n=4x=32) são encontradas em M. sativa ssp. falcata, M. lupulina L. M. papillosa Boiss. e M. prostrata Jacq. O nível hexaploide (2n=6x=48) é encontrado em M. saxatilis M.B. e M. cancellata M.B. Duas espécies, M. rugosa Desr. e M. scutellata Mill., possuem o número incomum de 2n=30 (LESINS; GILLIES, 1972; MCCOY; BINGHAM, 1988; QUIROS; BAUCHAN, 1988; MARIANI; FALISTOCCO, 1990; MARIANI; FALISTOCCO 1991).

A citogenética em alfafa e em espécies relacionadas não está tão desenvolvida como em outras plantas cultivadas. Seus cromossomos são relativamente pequenos (2–3 µm em células somáticas) e morfologicamente semelhantes. O fato de a alfafa cultivada ser um autotetraploide, com quatro genomas quase idênticos, dificulta a análise genética (MCCOY; BINGHAM, 1991; BAUCHAM; HOSSAIN, 1997).

A maioria dos trabalhos publicados relata determinações de número cromossômico somático, cariótipos (de cromossomos somáticos e paquiteno da meiose) e análises do comportamento meiótico de espécies e de populações (LESINS, 1957; STANFORD; CLEMENT, 1958; GILLIES, 1970a, 1970b; ARMSTRONG, 1971; STANFORD et al., 1972; MARIANI et al., 1978; SCHLARBAUM et al., 1984; BAUCHAN; CAMPBELL, 1994; MARIANI et al., 1996), e também de híbridos somáticos (PUPILLI et al., 1995).

O bandeamento cromossômico trouxe um maior poder de discriminação dos cromossomos dentro das espécies e entre elas. Trabalhos com banda-C levaram à identificação de bandas heterocromáticas na alfafa cultivada e em táxons diploides do complexo sativa-falcata, bem como à identificação dos cromossomos do cariótipo (MASOUD et al., 1991; MARIANI; FALISTOCCO, 1990; MARIANI; FALISTOCCO, 1991; FALISTOCCO; FALCINELLI, 1993; BAUCHAN; HOSSAIN, 1997; BAUCHAN; HOSSAIN, 2001) e de cromossomos extranumerários (HOSSAIN; BAUCHAN, 1999), além da verificação da existência de polimorfismo para a heterocromatina constitutiva dentro de diferentes genótipos e populações de alfafa e entre eles (BAUCHAN et al., 2002; BAUCHAN et al., 2003). Bandeamento N permitiu identificar os cromossomos das subespécies coerulea e falcata e distingui-los nos híbridos (BAUCHAN; HOSSAIN,1998).

Alguns trabalhos com FISH (Fluorescent in situ Hybridization) para os sítios 18S-5.8S-25S e 5S rDNA foram realizados com as subespécies diploides do complexo sativa-coerulea-falcata, com a alfafa cultivada e com M. glomerata. Além do mapeamento dos sítios nos cromossomos (CALDERINI et al., 1996; FALISTOCCO, 2000), foi verificado que o número de sítios nos tetraploides era o dobro do número de sítios nos diploides, e que a distribuição dos genes ribossomais foi mantida durante a evolução da forma silvestre diploide para a cultivada tetraploide (FALISTOCCO, 2000). FISH também foi empregado para verificar a distribuição dos locos de rDNA em populações naturais de M. truncatula (FALISTOCCO; FALCINELLI, 2003), analisar o cariótipo da espécie (CERBAH et al., 1999), examinar híbridos somáticos envolvendo M. sativa (CLUSTER et al., 1996) e, juntamente com GISH (Genomic in situ Hybridization), para comparar espécies anuais.

A quantidade de DNA nuclear, determinada para poucas espécies do gênero, varia de 3,90 pg/2C em M. glutinosa a 0,95 pg/2C para M. truncatula. M. sativa ssp. sativa tem 3,45 pg/2C, quase o dobro de sua provável espécie ancestral M. sativa ssp. coerulea (1,80 pg/2C) (BENNET; LEITCH, 2004).

A citogenética é uma ferramenta muito importante no melhoramento de alfafa (DALL´AGNOL; SCHIFINO-WITTMANN, 2000), principalmente pela manipulação dos níveis de ploidia, explorando a poliploidização sexual via gametas não reduzidos (SCHIFINO-WITTMANN; DALL´AGNOL, 2001), já que formas, populações e genótipos de alfafa e outras espécies de Medicago frequentemente produzem esse tipo de gametas.

Gametas não reduzidos são resultado de um processo meiótico anormal, em que a redução do número cromossômico não ocorre. Essa falha na redução pode ocorrer na meiose I, pela restituição na primeira divisão (RPD), ou na meiose II, pela restituição na segunda divisão (RSD) (PELOQUIN, 1981). Em alfafa, o pólen 2n é formado por RPD (VORSA; BINGHAM, 1979; TAVOLETTI et al., 1991), controlado pelo gene recessivo rp, de expressão altamente dependente do ambiente (MCCOY, 1982). A formação de gametas femininos 2n ocorre por RSD (PFEIFFER; BINGHAM, 1983; MCCOY; ROWE, 1986; TAVOLETTI et al., 1991).

Grãos de pólen “jumbo” (4n), formados por ausência de citocinese no final da meiose II, estão sob controle do gene recessivo jp, e híbridos entre M. sativa e M. dzhawakhetica ou M. rupestris foram recuperados em cruzamentos com plantas jp (MCCOY; SMITH, 1983; PFEIFFER; BINGHAM, 1983). Mapeamentos, utilizando RAPD e AFLP, detectaram vários QTLs (Quantitative Trait Loci) associados com a produção de oosferas 2n na alfafa diploide e sugeriram o envolvimento de, no mínimo, cinco genes (BARCACCIA et al., 2000).

Há vários trabalhos em alfafa, que exploram os níveis haploide, triploide, tetraploide e mesmo superiores.

Tetraploides produzidos por poliploidização sexual podem ter um desempenho melhor, em virtude das interações multialélicas, que são menores nos tetraploides somáticos. Além disso, gametas não reduzidos permitem a introgressão de genes de espécies diploides silvestres de Medicago para o conjunto gênico da alfafa tetraploide (VERONESI et al., 1986; MCCOY; BINGHAM, 1991; BARCACCIA et al., 1998).

Apesar de apresentarem uma certa diminuição na fertilidade (BARCACCIA et al., 1995; BARCACCIA et al., 1998), o que dificulta seu uso imediato em cultivo (BARCACCIA et al., 2003), os tetraploides obtidos por poliploidização sexual em alfafa são em geral mais produtivos que os genitores diploides, considerando diversos componentes de rendimento de forragem (MCCOY; ROWE, 1986; BARCACCIA et al., 1995, 1998).

Haploides são importantes para o desenvolvimento de alfafa cultivada no nível diploide, ACND (CADL – cultivated alfalfa at the diploid level) (BINGHAM; MCCOY, 1979). ACND é uma forma diploide que se reproduz por sementes. Haploides de M. sativa ssp. sativa (que têm o mesmo número de cromossomos das espécies silvestres diploides) podem ser cruzados, como genitores femininos, com M. sativa ssp. falcata, produzindo híbridos que combinam genes das formas cultivadas e das silvestres (MCCOY; BINGHAM, 1991).

Triploides de alfafa podem ser recuperados de cruzamentos 4x-2x e mesmo 2x-2x. Apesar de serem, em sua maioria, macho-estéreis, a fertilidade feminina é suficiente para que os triploides sejam utilizados como genitores femininos, o que permite a transferência gênica entre níveis de ploidia (BINEK; BINGHAM, 1970; BLAKE; BINGHAM, 1986; MCCOY; BINGHAM, 1988).

Hexaploides foram obtidos por poliploidização sexual em cruzamentos inter ou intraploides. Alguns foram mais vigorosos do que a alfafa tetraploide, instáveis quanto ao seu número cromossômico, mas com menor depressão endogâmica do que os diploides (BINGHAM; BINEK, 1969; BINGHAM; SAUNDERS, 1974). Híbridos somáticos hexaploides entre M. sativa ssp. sativa e M. sativa ssp. coerulea foram vegetativamente vigorosos e com produção de forragem comparável ao genitor mais produtivo (PUPILLI et al., 1995).

Embora com menor interesse, os outros níveis de ploidia, como penta (5x), hepta (7x) e octaploide (8x), podem ser utilizados em pesquisas de cunho acadêmico e, eventualmente, servir como ponte entre níveis de ploidia (MCCOY; BINGHAM, 1991).

Quanto aos aneuploides, apenas trissômicos primários foram identificados na alfafa em nível diploide, não havendo registro de monossômicos (MCCOY; BINGHAM, 1988). A construção de uma série completa de trissômicos foi considerada por McCoy e Bingham (1988) como um projeto em longo prazo, e, até o momento, pouco progresso houve nessa área. A construção de trissômicos é mais viável nas formas diploides do que na alfafa tetraploide.

Barcaccia et al. (2003), em revisão sobre o uso de mutantes reprodutivos (formadores de gametas não reduzidos), sugeriram que, além das possibilidades de poliploidização sexual e transferência gênica entre níveis de ploidia, o melhor estudo desses mutantes, aliado a mapeamento utilizando RFLPS e marcadores com base em PCR (Polimerase Chain Reaction), poderia levar à identificação de mutantes apomíticos, abrindo, dessa forma, a possibilidade de introduzir a apomixia em alfafa.

História antiga e domesticação

A alfafa é a cultura forrageira mais antiga para a qual se tem um nome, mas a etimologia da palavra é discutível. Pode ter surgido de modificações do persa aspo-asti (comida de cavalo), do árabe al-fasfasa ou do cachemir ashwa-bal (ambos significando poder de cavalo). Há especulações de que o nome lucerne, usado na Europa para alfafa, derivou do persa läjwärd para lápis-lázuli, em referência à flor azulada de M. sativa (RUSSELLE, 2001), mas esse nome poderia refletir um cultivo antigo na região do lago Lucerne (LANGER, 1995). Também é conhecida por medic, nomeada de acordo com o geógrafo e historiador grego Strabo, em virtude do local de sua origem, no antigo império da Média. A raiz da palavra permanece até mesmo no seu nome científico, Medicago (RUSSELLE, 2001).

Seu uso pré-data a história registrada. Sementes de alfafas silvestres foram identificadas em extratos de cerca de 6000 a.C. no atual Irã. Em Abu Hureyra – uma comunidade agrícola muito antiga na Síria –, foram identificados restos de sementes muito pequenas de leguminosas de cerca de 10000 a.C. Sementes de M. falcata foram encontradas num sítio de cerca de 4000 a.C. no Paquistão e 3000 a.C. e 2000 a.C. no Afeganistão e Cachemira (RUSSELLE, 2001).

Desde o início da civilização ocidental, os agricultores reconheceram os méritos da planta, por ser considerada um ótimo alimento animal, podendo ser utilizada na melhoria do solo, no aumento da produção de outras culturas, como alimento e como planta medicinal para o homem.

Os primeiros registros de sua utilização são encontrados nos tabletes de argila hititas, de cerca de 1300 a.C. (LANGER, 1995), relatando que os animais eram alimentados com alfafa durante o inverno e que era considerada um alimento nutritivo. Mais tarde (700 a.C.), foi incluída na lista de plantas de jardim de Merodoch-Baladan, um contemporâneo de Ezequias, rei da Judeia (RUSSELLE, 2001).

Pode-se dizer que a alfafa foi fundamental na expansão das civilizações conquistadoras, já que era o combustível para os cavalos. Como outras culturas, a alfafa viajou com o comércio e com os exércitos. Os hititas, conhecidos por seus carros puxados a cavalo, reinaram no Oriente Médio de 2400 a.C. a 1200 a.C. A alfafa chegou à Grécia com os medas, durante as Guerras Médicas comandadas por Dario (490 a.C.), e logo se estabeleceu na região, conforme os escritos de Aristófanes, de Aristóteles e de outros. Teofrasto (século 4 a.C.) relata que os gregos viram pela primeira vez as extensões verdes de alfafa quando o exército meda retirou-se, refletindo o cultivo da planta pelos invasores, para alimentar seus cavalos (LANGER, 1995; RUSSELLE, 2001).

Os romanos logo a adotaram e a tinham em alta estima, como registrado por Varro, Plínio, Columela e outros, e nos poemas de Virgílio. Registros de instruções detalhadas de plantio, manejo e fenação fornecem as evidências de que os romanos valorizavam altamente a alfafa por suas qualidades de produtividade, por seu valor nutritivo e por sua habilidade de melhorar o solo (LANGER, 1995; RUSSELLE, 2001).

Nos dois primeiros séculos d.C., a alfafa foi provavelmente distribuída pelo Império Romano. Após o colapso romano, a história da alfafa na Europa não é bem documentada. Depois do período romano, não há menção de alfafa até a metade do século 16, quando os espanhóis a levaram para a França e para os Países Baixos (LANGER, 1995; RUSSELLE, 2001).

No século 2 a.C., o Caminho da Seda abriu-se à China. O imperador Wu-Ti enviou uma missão à Ásia Central para adquirir cavalos iranianos e, junto com os cavalos, a alfafa chegou à China (LANGER, 1995; RUSSELLE, 2001).

Os mouros provavelmente levaram-na para o norte da África e depois para a Espanha, quando a invadiram em 711, o que indica duas introduções diferentes (romana e moura) na Espanha.

Muller et al. (2003) analisaram RFLP de DNA mitocondrial em várias populações de M. sativa, silvestre e cultivada, da Europa, do Oriente Próximo e da Ásia Central. Os dados sugerem fortemente duas rotas independentes de disseminação da alfafa, a partir de seu centro de origem, e mostram que algumas populações selvagens poderiam ter contribuído para o pool gênico da cultivada.

História recente

A partir da Renascença, há novamente amplas referências à alfafa na Europa. No século 16, descrições de plantas com flores amarelas sugerem que essa forma seria a M. sativa ssp. falcata. Nos séculos 16 e 17, há registros de sua utilização na Itália, e Tarterllo recomenda a rotação de culturas incluindo alfafa. Em 1600, Olivier de Serres refere-se a um amplo cultivo da alfafa na Espanha e no sul da França. Em 1650, sementes foram importadas para a Inglaterra a partir da França. Em 1876, a alfafa já era recomendada para duplicar a produção de forragem nas fazendas inglesas (RUSSELLE, 2001).

No século 16, chegou ao Novo Mundo com os exploradores portugueses e espanhóis. Aparentemente, foi introduzida no Peru em 1534 por Cristobal Gago (RUSSELLE, 2001) e, posteriormente, espalhou-se para outros locais da América do Sul (LANGER, 1995). Segovia-Lerma et al. (2003) verificaram, por meio de AFLP, que as populações peruanas por eles analisadas eram mais semelhantes às introduções originais espanholas na América do Sul do que as chilenas.

Apenas no século 18, a alfafa cruzou os Andes rumo à Argentina, onde se adaptou muito bem e, rapidamente, tornou-se um componente crucial de pastagens melhoradas (RUSSELLE, 2001).

Do México, foi levada por missionários para o sul dos Estados Unidos e, no século 19, foi intensamente introduzida na Califórnia (chamada de trevo-chileno), onde se estabeleceu bem, embora seu uso no norte dos Estados Unidos dependesse da introdução de material tolerante ao frio. Lotes de sementes, provavelmente da ssp. x varia, foram trazidos aos Estados Unidos, entre eles um lote de alfafa híbrida levada a Minessota por Wedelin Grimm, colono alemão, o que deu origem a uma importante cultivar que leva seu nome (LANGER, 1995).

Por volta de 1800, chegou à Nova Zelândia, vinda provavelmente da Europa ou da Argentina. Acredita-se que ocorreram várias introduções na Nova Zelândia, o que explica a natureza híbrida de algumas cultivares iniciais, como a Marlborough. Na Austrália, foi introduzida na mesma época, e a Hunter River, derivada da linhagem francesa Provence (mas também com outros componentes), tornou-se a mais importante das cultivares iniciais. Na metade de 1800, a alfafa foi da França para a África do Sul, inicialmente usada em ranchos de avestruz. Atualmente, a área cultivada é em torno de 304 mil hectares, sendo relatados stands de até 80 anos (LANGER, 1995; RUSSELLE, 2001).

Melhoramento

A história recente da alfafa tem sido dominada principalmente por tentativas de reduzir os efeitos de pestes e doenças na produtividade e persistência (LANGER, 1995). Uma ampla variedade de organismos patogênicos (fungos, bactérias, vírus, nematoides e insetos) causa doenças sérias, como murcha, antracnose, ferrugens, leaf spots. Outros organismos, como lagartas, afídios e coleópteros, podem diminuir a produtividade e persistência da alfafa. A resistência a doenças e pestes tem sido o principal objetivo dos melhoristas, não só para manter a produtividade como também para diminuir o custo do controle químico e da poluição ambiental. Muito sucesso foi obtido no melhoramento de cultivares resistentes, as quais mantêm a produção, a digestibilidade e outras características importantes. Outros objetivos incluem melhora da adaptação geográfica, tolerância ao frio, qualidade e produção de feno, silagem e farinha de alfafa e persistência sob pastejo (LANGER, 1995).

Os programas de melhoramento comercial, em geral, visam a características de mercado, mas caracteres agronômicos maiores, como produção de biomassa e tolerância ao frio, são muito importantes. Em resposta à temperatura e ao fotoperíodo, a alfafa (nos locais em que há invernos rigorosos) se aclimata para o inverno com alteração de algumas características, como altura e produção de biomassa. As plantas não dormentes têm pouca ou nenhuma aclimatação, mas produzem mais no outono do que as dormentes. A relação negativa entre produção de biomassa e tolerância ao inverno complica o melhoramento simultâneo das duas características (BRUMMER, 2004).

O melhoramento de alfafa pode ser auxiliado pela citogenética (como apresentado anteriormente), por meio de técnicas biotecnológicas e de marcadores bioquímicos e moleculares.

A cultura de tecidos e de regeneração de plantas em alfafa tem sido bastante empregada, com objetivos básicos e aplicados, tais como micropropagação, manipulação da embriogênese somática, utilização da variação somaclonal, estratégias de seleção in vitro, fusão de protoplastos, híbridos somáticos interespecíficos, sementes sintéticas e desenvolvimento de transgênicos, (BINGHAM et al., 1988; REDENBAUGH et al., 1986; FINSTAD et al., 1993; PICCIONI et al., 1996; NENZ et al., 1996; STANDARDI; PICCIONI, 1998; PUPILLI et al., 1995, 2001; MOLTRASIO et al., 2004).

Isoenzimas têm sido utilizadas em estudos de determinação de herança e na caracterização de espécies e formas de Medicago (QUIROS; MORGAN, 1981; QUIROS, 1982, 1983; SMALL et al., 1992, 1999; CORTS; MARTINEZ, 2000).

Além de auxiliarem no estabelecimento de relações filogenéticas em espécies anuais (BRUMMER et al., 1995; MARIANI et al., 1996; BENA et al., 1998) e perenes de Medicago (CAMPBELL; BAUCHAN, 2002), os marcadores moleculares de DNA também vêm sendo extensivamente utilizados para, por exemplo, verificar a variabilidade dentro de populações, ecotipos e cultivares de alfafa (CROCHEMORE et al., 1998; MUSIAL et al., 2002; BRUMMER et al., 1991; PUPILLI et al., 2000), a diferenciação de populações e cultivares de origem diversa (DENGHAN-SHOAR et al., 1997; MENGONI et al., 2000) e a identificação de híbridos somáticos (PUPILLI et al., 1995, 2001; NENZ et al., 1996).

A identificação de QTLs ligados a características de interesse também vem sendo feita. Por exemplo, Tavoletti et al. (2000) usaram RFLP para identificar QTLs relacionados com o gene jp (jumbo pollen). Uma das características que vêm sendo buscadas no melhoramento de alfafa é a tolerância ao alumínio. Sledge et al. (2002) utilizaram RFLPs para identificar QTLs para tolerância ao alumínio na diploide M. sativa ssp. coerulea com o objetivo de serem usados para transferir a tolerância para alfafa tetraploide cultivada. Sledge et al. (2005a) verificaram variação para tolerância a alumínio em M. truncatula, indicando a possibilidade de utilização dessa espécie no melhoramento da alfafa cultivada.

A transgenia vem sendo utilizada no melhoramento de alfafa, na tentativa de introduzir características desejáveis por transformação genética. Austin et al. (1994) comentaram sobre as possibilidades e o potencial de transformar a alfafa para produção de enzimas industriais importantes, como alfa-amilase e lignina-peroxidase dependente de manganês. As plantas cresceriam no campo, e as enzimas seriam extraídas delas.

A alfafa cultivada não é facilmente transformável. A transformação via Agrobacterium é a mais bem-sucedida (DESGAGNÉS et al., 1995; NINKÓVI et al., 1995).

Os resultados com a transgenia em alfafa são relativamente promissores, tanto para resistência a estresses ambientais e a doenças, como para síntese de substâncias desejáveis. Micallef et al. (1995) mencionaram a possibilidade de melhorar a alfafa transgênica por retrocruzamentos.

Plantas transgênicas de alfafa, superexpressando a Mn-superóxido dismutase, sobreviveram melhor ao inverno, muitas possuíam taxas de produção maiores (McKERSIE et al., 1993) e tenderam a apresentar menor dano causado por estresse de déficit hídrico e melhor sobrevivência após três anos do que as não transgênicas (McKERSIE et al., 1996).

Rosellini et al. (2001) obtiveram plantas de alfafa transformadas com o gene barnase, que expressaram modificações celulares indicativas de macho-esterilidade, sinalizando a possibilidade de utilizar esse tipo de mutantes para criar plantas macho-estéreis e cultivares híbridos altamente heteróticos.

Na alfafa transgênica expressando alfa-amilase e lignina-peroxidase-dependente-de-manganês, as plantas produzindo alfa amilase não mostraram alteração de fenótipo nem decréscimo da produção de matéria seca, mas a produção de peroxidase-dependente-de-manganês, em geral, afetou o crescimento e o desenvolvimento das plantas (AUSTIN et al., 1995).

Tabe et al. (1995) tentaram melhorar o valor nutritivo da alfafa introduzindo genes que aumentassem a produção de aminoácidos ricos em enxofre (metionina e cisteína), os quais são limitantes para o crescimento da lã em ovinos. O aumento da produção da proteína pelas plantas transgênicas não foi suficiente para suprir a quantidade mínima diária de aminoácidos sulfurosos.

Hipskind e Paiva (2000) transformaram alfafa para síntese de resveratrol-sintase. As plantas transgênicas acumularam um novo composto identificado como trans-resveratrol, que inibiu o crescimento do fungo Phoma medicaginis, que ataca as plantas e se alastra no campo em virtude da esporulação do patógeno.

Avraham et al. (2005), para aumentar o nível de metionina e a qualidade nutricional de alfafa, produziram transgênicos expressando o gene para cistationina sintase, a enzima que controla o primeiro metabólito intermediário na síntese de metionina.

Considerando a facilidade de fluxo gênico dentro e entre a alfafa cultivada e seus parentes silvestres, há necessidade de uma avaliação criteriosa da dispersão do pólen quando do plantio de plantas transgênicas.

Amand et al. (2000), utilizando RAPD, observaram movimento de pólen de até 34 m dentro dos campos e de 1.000 m entre campos e fluxo gênico de até 230 m, e sugeriram que uma distância mínima de 1.577 m pode ser necessária para evitar o fluxo gênico em alfafa.

A elaboração de um mapa genético da alfafa tem sido um objetivo dos pesquisadores há algum tempo e, nesse sentido, os marcadores moleculares vêm contribuindo bastante tanto para mapeamento nas formas diploides, o que é mais fácil, como nas tetraploides.

Mapas de ligação nas formas diploides do complexo sativa vêm sendo realizados por RAPD e RFLP (ECHT et al., 1994), AFLP (BARCACCIA et al., 1999) e SSR (DIWAN et al., 2000). Também no nível tetraploide foram feitos alguns trabalhos de mapeamento. Brower e Osborn (1999), utilizando RFLPs, verificaram que a ordem dos locos no mapa estava, em geral, de acordo com aquela encontrada na alfafa diploide. Julier et al. (2003), com AFLP e SSR, verificaram uma alta colinearidade entre os genomas de M. sativa e M. truncatula. Musial et al. (2005) construíram um mapa de ligação para a alfafa adaptada ao norte da Austrália, com RAPD, AFLP e SSR, e identificaram dois QTLs associados com resistência a Phytophthora medicaginis. Ma et al. (2002) desenvolveram método estatístico para mapear QTLs na alfafa tetraploide. Sledge et al. (2005b) utilizaram marcadores SSR (Simple Sequence Repeat) derivados basicamente de ESTs (Expressed Sequence Tags) e BACS (Bacterial Artificial Chromosomes) de M. truncatula, detectando oito grupos de ligação, num mapa total de 624 cM.

M. truncatula (barrel medic), 2n=2x=16, é um organismo modelo e uma boa forrageira com qualidade comparável à da alfafa, importante na Austrália, onde é um componente integral do sistema de alternância cereais–pastagens. Possui várias características interessantes que a tornam um modelo adequado para estudar a biologia das leguminosas: é diploide, de autofecundação, com genoma pequeno (500–600 Mbp/1c), tempo curto de geração, alta diversidade, várias cultivares disponíveis, além de existirem coleções de mutantes, bibliotecas de BACs, bibliotecas de cDNA e métodos eficientes para sua transformação. Seu genoma e o da alfafa são similares (CHOI et al., 2004) e ela poderia ser utilizada como uma fonte de genes para M. sativa (FRUGOLI; HARRIS, 2001, THOQUET et al., 2002; SLEDGE et al., 2005b).

Um consórcio internacional para sequenciar o espaço gênico eucromático de M. truncatula foi iniciado na Universidade de Oklahoma em 2001 e conta com o apoio de recursos de bioinfomática e bases de dados. A estratégia de sequenciamento baseia-se em BACS ancorados por marcadores (marker-anchored Bacterial Artificial Chromosomes) e processo de anotação automática. Quatro centros mundiais nos Estados Unidos e na Europa coordenam o projeto (CANNON et al., 2005). Um mapa citogenético molecular foi construído com base em um cariograma no paquíteno corado com DAPI e a posição de sequências repetitivas 5S rDNA, 45SrDNA e NMtR1. A correlação entre os grupos genéticos de ligação e os cromossomos foi feita por mapeamento por FISH de clones BAC. O estabelecimento dessa metodologia, já que os cromossomos em paquiteno são maiores e permitem uma resolução melhor, criou a base para a integração dos mapas moleculares, genéticos e citogenéticos na espécie (KULIKOVA et al., 2001). A Medicago Genome Initiative (BELL et al., 2001) pretende reunir uma base de dados de EST de M. truncatula disponível ao público.

Em outubro de 2005, mais de 50% do processo de sequenciamento estavam concluídos, em torno de 160 Mbp, com predição de 25 mil genes (TOWN, 2006). O mapa de M. truncatula, havendo principalmente integração dos mapas moleculares, genéticos e citogenéticos, irá contribuir para o melhoramento da alfafa cultivada e poderá também ser utilizado para comparação com outras espécies de Medicago e demais leguminosas (PATERSON et al., 2000), incluindo estudos de colinearidade.

Perspectivas

Além do melhoramento clássico, a genômica pode ser útil para o melhoramento de alfafa, por meio da seleção assistida por QTL, captura de heterose, assim como na pesquisa básica com M. truncatula e na manipulação de características monogênicas por biotecnologia.

Brummer (2004) discute claramente esses aspectos. Segundo ele, muitos dos objetivos essenciais do melhoramento podem continuar sendo atingidos com os métodos tradicionais. A ênfase comercial no uso da genômica será para características com vantagem de mercado, mas deve haver esforços para melhorar características complexas fundamentalmente importantes, como tolerância ao frio e produção de biomassa. Para melhoramento em longo prazo, a pesquisa deverá ser fixada em: a) construir um panorama abrangente dos recursos genéticos silvestres e cultivados; b) desenvolver processos para encurtar o ciclo e aumentar as herdabilidades; c) desenvolver cultivares alternativas que utilizem o potencial genético dentro dos grupos de germoplasma e entre eles; d) facilitar a criação e manutenção de variação genética para características quantitativas maiores em populações diversas. O uso de métodos genômicos para caracterizar germoplasma exótico, dissecar características quantitativas e identificar possíveis loci poderia resolver esses problemas. A incorporação das técnicas genômicas no processo de melhoramento será um desafio, mas muitos desses problemas podem ser superados com esforço. O autor também chama a atenção para o que denomina paradoxo da era da genômica: a diminuição de recursos para os programas de melhoramento pode levar a altíssimos investimentos em soluções de alta tecnologia; no entanto, tais investimentos correm o risco de não serem aplicados para o desenvolvimento de novas cultivares. Sem programas efetivos e ativos de melhoramento, a genômica fica impossibilitada de contribuir efetivamente para os ganhos genéticos de características importantes tanto na alfafa quanto em outras culturas.

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