Capítulo 1
Ecofisiologia vegetal:
aspectos bioquímicos
e moleculares

Giovani Greigh de Brito

Napoleão Esberard de Macêdo Beltrão

Introdução

Ecofisiologia, originariamente, é a autoecologia dedicada ao comportamento de plantas individuais, espécies ou táxons superiores, viz. “fisiotipos”, em determinados habitats (LÜTTGE; SCARANO, 2004). Esses autores discorrem que, historicamente, vários cientistas – desde Ernst Haeckel (1834–1919), o grande popularizador da teoria evolucionária na Alemanha e autor da definição original do termo ecologia, em 1866, até Stephen Jay Gould (GOULD, 1977) – contribuíram para cunhar a definição mais apropriada de ecofisiologia. Entretanto, a definição original de Haeckel, auxilia no delineamento histórico do termo.

Lüttge e Scarano (2004) delinearam, por meio de um apanhado histórico, o significado do termo ecologia. Segundo esses autores, Alexander Von Humboldt (1769–1859) tornou-se o fundador da geografia de plantas depois de descobrir que a fisiognomia da vegetação é determinada por condições ambientais e que a distribuição de plantas é dependente do clima (HUMBOLDT, 1982). Na teoria da evolução proposta por Charles Darwin (DARWIN, 1859), o impacto de fatores ambientais sobre organismos tornou-se aspecto essencial na seleção natural. Subsequentemente, Andreas Franz Wilhelm Schimper (1856–1901), que efetuou várias expedições aos trópicos, fundou a geografia de plantas sobre as bases ecológicas (SCHIMPER, 1898) e também reconheceu a necessidade da experimentação fisiológica. Finalmente, Ernst Stahl (1848–1919), que introduziu a experimentação em pesquisas ecológicas (LANGE et al., 1981; LÜTTGE, 1997; MÄGDEFRAU, 1992), é considerado o descobridor da ecofisiologia. No início do século 20, pesquisadores, como Otto Stocker (1888–1979) e Bruno Huber (1899–1969), contribuíram significativamente com a ecofisiologia de plantas em virtude do desenvolvimento de instrumentos que puderam ser levados a campo para medições do comportamento de plantas em condições ambientais naturais, especialmente para estudos de fotossíntese e de respiração. Simultaneamente, avanços em estudos de características adaptativas funcionais de plantas, sob condições de campo, foram efetuados no Brasil. Ressalta-se ainda que Paulo de Tarso Alvim, Karl Arens, Leopoldo Magno Coutinho, Mário Guimarães Ferri e Luiz Gouvêa Labouriau estão entre os ecofisiologistas brasileiros ativos desde a década de 1960, os quais deram sua importante contribuição à ecofisiologia (ALVIM; ALVIM, 1976; ARENS, 1958; COUTINHO, 1990; FERRI, 1944; LABOURIAU, 1966) (Tabela 1).

Tabela 1. Definição histórica no desenvolvimento da ecofisiologia.

Autor

Contribuição

Publicação

Alexander

von Humboldt (1769–1859)

Definiu a geografia de plantas

(HUMBOLDT, 1982)

Charles Darwin (1809–1882)

Postulou a teoria da evolução

(DARWIN, 1859)

Andreas Franz Wilhelm Schimper (1856–1901)

Reconheceu a necessidade da experimentação fisiológica

(SCHIMPER, 1898)

Ernst Haeckel (1834–1919)

Definiu originalmente o termo ecologia

(HAECKEL, 1866)

Otto Stocker (1888–1979) e Bruno Huber (1899–1969)

Desenvolveram instrumentos para medições, a campo, para fotossíntese e respiração

(STOCKER; VIEWEG, 1960; HUBER, 1956)

Fonte: Lüttge e Scarano (2004).

Após esse breve histórico, é importante ressaltar que, neste capítulo, serão discutidos aspectos bioquímicos e moleculares que fazem parte de abordagens atualmente utilizadas em estudos da interação planta-ambiente. Serão apresentados e discutidos avanços obtidos na compreensão de mecanismos e de vias de sinalização de plantas em respostas a estresses ambientais, que fazem parte da ecofisiologia vegetal.

Respostas de plantas a estresses abióticos

Atualmente, o aprimoramento das técnicas existentes e o desenvolvimento de novas ferramentas para o estudo das respostas de plantas às variáveis ambientais, somados às novas demandas, têm conduzido, cada vez mais, à necessidade de integração de estudos efetuados sob condições de campo com os de laboratórios e de câmaras de crescimentos com ambientes controlados. Além disso, é necessário o desenvolvimento de ferramentas para a caracterização fenotípica em grande escala e de forma não destrutiva para as mais variadas condições de cultivo.

É fato que, a cada dia, cresce a quantidade de informações relacionadas às respostas de plantas a estresses abióticos. Entretanto, as informações obtidas, com raras exceções têm sido utilizadas com sucesso em programas de melhoramento para a tolerância a estresses abióticos. Isso é resultado, dentre outros fatores, do grau de compreensão a respeito das bases fisiológicas e moleculares que determinam essas respostas. Todavia, as pesquisas genômicas e pós-genômicas demonstram ser promissoras para auxiliar no melhoramento genético de culturas agrícolas. Incluem-se como parte dessas ferramentas as diferentes classes de marcadores moleculares; a identificação de genes para características agronomicamente importantes; a construção de biblioteca artificial de bactéria com grandes insertos (BAC) e de cDNA; a clonagem e a obtenção de sequências expressas de gene tags (ESTs), via sequenciamento único ou de ambas extremidades de clones cDNA, utilizadas para rapidamente identificar e caracterizar genes em larga escala e de modo eficiente; bem como os projetos de sequenciamento de genomas inteiros que estão atualmente em andamento para espécies agronomicamente importantes. Essas ferramentas oferecem uma excelente oportunidade para que se amplie o conhecimento sobre os mecanismos que as plantas utilizam para responder às variações ambientais. Em anos recentes, com a massificação das informações relacionadas aos impactos potenciais oriundos do cenário climático futuro, uma nova ordem está sendo definida. Somente pela integração de cientistas das mais diferentes áreas do conhecimento, avanços mais rápidos e informações mais consistentes poderão ser obtidas. Nesse sentido, o emprego de ferramentas da biologia molecular poderá contribuir, sobremaneira, para a compreensão dos mecanismos que desencadeiam as respostas de plantas a estresses abióticos, o que já vem ocorrendo de forma acelerada para algumas espécies.

Verifica-se que raros são os períodos em que as plantas estão sob condições não estressantes, nas quais se incluem o deficit hídrico, a salinidade e as temperaturas extremas. A tolerância ou a sensibilidade a estresses abióticos são fenômenos complexos, considerando-se que muitos estresses ocorrem em estádios múltiplos do desenvolvimento da planta e, muitas vezes, mais de um estresse pode afetá-la simultaneamente. A percepção do estresse e a transmissão do sinal que desencadeia as respostas de aclimatação constituem passos-chave para a tolerância da planta àquela variável. Como resultado, a diferença nos níveis de tolerância ao estresse, entre genótipos ou mesmo dentro do genótipo em diferentes estádios de desenvolvimento, pode estar relacionada às diferenças na capacidade de percepção e de transdução do sinal que desencadeia a resposta.

Com relação aos sensores de estresses, pouco se conhece sobre sua existência em plantas, e as informações definitivas referem-se às conversas cruzadas (cross-talk) entre diferentes vias de transdução de sinal. Entretanto, vias de sinalização com componentes comuns não podem necessariamente ocorrer em conversa cruzada, se esses componentes estiverem ligados a complexos proteicos distintos.

Vários estresses abióticos resultam em efeitos gerais e específicos sobre o crescimento. Dessa forma, plantas que crescem sob condições limitantes de água apresentam crescimento limitado por causa do declínio da fotossíntese e da interferência na disponibilidade de nutrientes que resulta do processo de secagem do solo. A salinidade interfere no crescimento bem como conduz à seca fisiológica e à toxidez por íons. Temperaturas subótimas podem também levar ao estresse osmótico, além de produzir efeitos diretos sobre o metabolismo (ZHU, 2002). Portanto, estresses osmóticos e oxidativos demonstram ser consequência da exposição à seca, à salinidade e a baixas temperaturas. A prevenção ao estresse osmótico causado pela seca depende do controle estomático e da maximização da absorção de água, por meio do crescimento de raízes e do ajuste osmótico. Durante o estresse salino, o ajuste osmótico desempenha seu papel na manutenção da homeostase osmótica, enquanto, sob estresse osmótico induzido por baixas temperaturas, previne ou retarda a formação de cristais de gelo (ZHU et al., 2004). Como parte das respostas de plantas ao estresse, a regulação da expressão gênica também envolve mudanças únicas e gerais nos níveis de transcritos para certos genes (SHINOZAKI; YAMAGUCHI-SHINOZAKI, 2000). A despeito da presença de mecanismos de tolerância gerais e específicos, especula-se que as plantas possuam vias múltiplas de percepção e transdução de sinais, os quais podem se cruzar em alguns pontos nessas vias (CHINNUSAMY et al., 2004).

Sensores a estresses abióticos

A especificidade na sinalização prevê que cada sinal de estresse possua um sensor que pode transduzir especificamente esse sinal para células-alvo. Atualmente, poucos são os sensores identificados, especialmente em plantas. Além disso, segundo a literatura, não existem informações suficientes para assegurar que a conversa cruzada possa ocorrer nos sensores (CHINNUSAMY et al., 2004). Dois componentes de um sistema (uma histidina kinase e um regulador de resposta) funcionam como sensores de estresse em bactérias e em levedura. Por exemplo, o componente duplo de histidinas kinases (HIK 33) em Bacillus subtilis tem sido sugerido ser um termossensor (AGUILAR et al., 2001; SUZUKI et al., 2000).

O maior nível de compreensão dos mecanismos moleculares em relação a sensores, em resposta ao baixo potencial hídrico, foi obtido usando levedura como organismo-modelo para o estudo. O synthetic lethal of N-end rule 1 (SLN1), um componente da histidina kinase, que constitui um dos poucos osmossensores conhecidos em levedura, pode perceber alterações na pressão de turgor por mecanismos desconhecidos. O SH3-domain osmosensor 1 (SHO1) possui função similar (WANG et al., 2008). Em levedura, uma histidina kinase osmossensorial (SLN1) percebe o estresse osmótico, ativa a high-osmolarity glycerol response 1 (HOG1) e leva a uma cascata de kinase. Considerando-se a elevação dos níveis de transcritos induzíveis por esse estresse, bem como os estudos para complementar leveduras mutantes sln 1-ts nulas, de modo que se recupere sua capacidade osmossensorial, a histidina kinase em Arabidopsis thaliana (ATHK1) passa a ser considerada candidata a um osmossensor (URAO et al., 1999). A expressão do gene ATHK1 é aumentada durante estresse salino e baixa temperatura. Quando expresso em levedura, ATHK1 leva ao aumento do grau de tolerância à osmolaridade em mutantes duplos (sln1∆ e sho1∆), sem ambos osmossensores, demonstrando que ATHK1 pode ativar a via MAPK HOG1 em levedura (URAO et al., 1999).

Algumas proteínas kinases semelhantes a receptores têm sido relacionadas às respostas ao estresse. Análises em plantas de tabaco transgênicas evidenciam que tanto o estresse mecânico quanto o salino e o osmótico induzem a expressão de NtC7. Além disso, a proteína resultante (C7), semelhante a receptores de membrana, pode desempenhar papel importante na tolerância ao estresse osmótico (TAMURA et al., 2003). A determinação in vivo da função desses supostos sensores em plantas e a identificação de sinalizadores intermediários serão necessárias para determinar se esses sensores são específicos ou estão envolvidos em conversa cruzada (cross-talk) entre diferentes vias de sinalização ao estresse.

Em Arabidopsis thaliana, análises do acúmulo de mRNA revelaram que transcritos de ATHK1 foram mais abundantes em raízes do que em outros tecidos sob condições de alta e de baixa osmolaridade. Considerando-se que as raízes representam a interface entre a planta e o ambiente solo e estão envolvidas na aquisição de nutrientes e nas respostas a condições ambientais, bem como gravidade, disponibilidade de água e temperaturas, nova evidência é apresentada para reforçar a corrente de que sensores para estresse hídrico, localizados nas raízes, desempenham funções importantes na resposta ao estresse. Além disso, tem sido verificada que a expressão de GUS dirigida pelo promotor de ATHK1 foi significativamente aumentada em raízes em resposta a mudanças na osmolaridade externa. Esses resultados indicam que a expressão de ATHK1 é transcricionalmente regulada por alterações na osmolaridade externa (CHINNUSAMY et al., 2004).

Estudos têm evidenciado o acúmulo de mRNA de vários genes envolvidos em etapas das vias de transdução de sinal. Entre esses, destacam-se proteínas kinases, fosfatases, fosfolipase C, calmodulinas, pequenas proteínas de ligação a GTP e fatores transcricionais que se acumulam em resposta a estresses (ZHU et al., 2005). Desse modo, a coordenação dos níveis de expressão desses genes conferem alta sensitividade e eficiência na sinalização em processos de transdução celular. Segundo estudos, a expressão de ATHK1 em raízes e na parte aérea pode ser necessária para maior sensitividade às mudanças nas condições ambientais (ZHU et al., 2005). O deficit hídrico, a salinidade e as baixas temperaturas podem induzir respostas específicas, sendo provável o envolvimento de sensores diversos em vias de sinalização ao estresse (BOUDSOCO; LAURIÈRE, 2005). Entretanto, poucas são as informações consistentes sobre esses sensores em plantas. O mapeamento, a clonagem e o estudo da função e da regulação de genes ATHK1 de A. thaliana abrem novas possibilidades de estudos para identificação e elucidação dos mecanismos regulatórios presentes nesses sensores e de sua relação com diferentes estresses.

Verifica-se ainda que, sob estresses, ocorre o influxo de Ca2+ para o citoplasma celular (KNIGHT, 2000). Portanto, os canais responsáveis por esse influxo podem representar mais um dos tipos de sensores para esses sinais de estresse. A ativação desses canais por temperaturas subótimas pode resultar em alterações físicas na estrutura celular. Esse fenômeno foi demonstrado em estudo no qual o influxo de Ca2+ induzido por frio ocorreu em plantas somente sob queda rápida de temperatura. Além disso, a fluidez da membrana e a reorganização do citoesqueleto estão envolvidas nas etapas iniciais de sinalização pelo frio (SANGWAN et al., 2001).

A multiplicidade de sinais relacionados a estresses abióticos tem levado cientistas a crer que existem vários sensores envolvidos na percepção desses sinais. Uma das primeiras respostas à baixa temperatura e ao deficit hídrico em células de plantas é o aumento transiente de Ca2+ citosólico derivado do influxo a partir do espaço apoplástico, ou pela sua liberação de estoques internos (KNIGHT, 2000). A liberação de Ca2+ interno é controlada por canais de Ca2+ ligantes sensitivos. Esses ligantes são mensageiros secundários que têm sido descritos em células animais, incluindo inositol polifosfatos, ADP ribose cíclico e ácido nicotínico adenina dinucleotídeo fosfato. Essas moléculas desempenham papéis nos quais induzem a liberação do Ca2+ em células vegetais e, em particular, nas células-guarda (SCHROEDER et al., 2001). Um importante aspecto da função do Ca2+ como um sinal é a presença de mudanças transientes de Ca2+. Essas mudanças podem ser geradas, numa primeira etapa, por mensageiros secundários e por moléculas sinalizadoras, como o ácido abscísico (ABA), que pode ser produzido como resultado da cascata pelos primeiros sinais de Ca2+ (Figura 1). Essas etapas de sinais de Ca2+ podem conduzir a diferentes consequências na sinalização e, portanto, no significado fisiológico (ZHU et al., 2005).

Figura 1

Figura 1. Repetidas alterações transientes de Ca2+ na percepção de sinais primários. O aumento primário de Ca2+ citosólico facilita a geração de moléculas sinalizadoras secundárias, as quais estimulam uma segunda etapa de incremento transiente de Ca2+, tanto local quanto global. No segundo caso, o aumento transiente de Ca2+ pode regular por feedback cada uma das etapas anteriores (não mostrado). Ca2+ transientes oriundos de fontes diferentes podem conduzir a diversas significâncias biológicas e resultar em diferentes outputs. Moléculas sinalizadoras secundárias, como as espécies reativas de oxigênio (ROS), podem também regular diretamente a transdução de sinal sem que haja Ca2+.

Fonte: adaptado de Xiong et al. (2002b).

Alterações metabólicas e genéticas causadas pelos estresses abióticos a partir da síntese dos mensageiros secundários na membrana celular

Como barreira seletiva entre células vivas e o seu ambiente externo, a membrana celular desempenha um papel-chave na percepção e na transmissão de informações externas. Sob estresse osmótico, mudanças são detectadas na composição de fosfolipídeos de plantas e de outros organismos (MUNNIK et al., 1998). Entretanto, durante a exposição ao estresse, o maior papel desempenhado pelos fosfolipídeos, principais componentes da membrana celular, decorre da sua função como precursores da geração de moléculas, os quais atuam como mensageiros secundários. Embora as enzimas fosfolipases A2, C e D sejam consideradas relevantes no processo de sua clivagem, a mais estudada é a fosfoinositídeo fosfolipase C (PI-PLC). Essa enzima hidrolisa o fosfotidil-inositol 4,5 bisfosfato (PIP2) durante sua ativação. O PIP2 constitui um sinal e pode estar envolvido em vários processos, entre os quais o recrutamento de complexos sinalizadores para sua montagem e localização específica na membrana. Em células animais, pelo fato de dessensibilizar o fluxo de K+ estimulado pela proteína G, o PIP2 poderia afetar diretamente a homeostase celular. Durante estresse osmótico, o PIP2 pode ainda induzir a expressão de PI5K (MIKAMI et al., 1998), um gene que codifica para fosfatidil inositol 4-fosfato 5-kinase responsável pela síntese de PIP2. Consistente com essa observação, o estresse osmótico leva ao incremento rápido dos níveis de PIP2 em culturas de células de A. thaliana (DEWALD et al., 2001). Estresses por deficit hídrico ou excesso de sal também levam à superexpressão dos níveis de mRNA para certas isoformas de PI-PLC (KOPKA et al., 1998). Esses aumentos na expressão de PI-PLC poderiam contribuir para incrementar a clivagem de PIP2, o que resulta em duas moléculas com funções importantes: diacilglicerol e inositol 1,4,5-trifosfato (IP3). Diacilglicerol e IP3 são mensageiros secundários que podem ativar proteínas kinase C e disparar a liberação de Ca2+, respectivamente.

Em plantas, a função do IP3 exógeno na liberação de Ca2+ de estoques celulares tem sido reportada (SCHROEDER et al., 2001). Aumentos transientes de IP3 foram encontrados em plantas expostas a fatores como: luz, patógenos, gravidade, anoxia, entre outros (STEVENSON et al., 2000). Tem sido verificado aumento nos níveis de IP3 em plantas submetidas a estresse salino, e o tempo para o aumento correlaciona-se com as mudanças nos níveis de Ca2+ citosólico (DEWALD et al., 2001). Aumentos transientes nos níveis de IP3 têm sido também observados em tecidos de plantas ou em culturas de células durante estresse salino (TAKAHASHI et al., 2001). A inibição da atividade de PI-PLC anula o aumento transiente de IP3 e inibe a indução de RD29A e COR47, genes relacionados ao estresse osmótico. O hormônio do estresse (ABA) também elicita aumentos transientes nos níveis de IP3 em células-guarda de Vicia faba, bem como em plântulas de A. thaliana (SANCHEZ; CHUA, 2001; XIONG et al., 2001b).

Dado o papel crítico do IP3 na sinalização, os níveis celulares desse composto necessitam ser finamente regulados por meio da síntese e da degradação. Estudos bioquímicos sugerem que, em células animais, o IP3 seja degradado por uma via que envolve inositol polifosfato 3-kinase ou por inositol polifosfato 5-fosfatase (Ins5Pase), o que resulta na geração de inositol 1,3,4,5-tetrafosfato e de inositol 1,4-bifosfato [Ins(1,4)P2], respectivamente. Entretanto, em plantas, as informações que registram o turnover (equilíbrio entre síntese e degradação) do IP3 são ainda limitadas. Estudos que relacionam os níveis de IP3 e a expressão gênica evidenciam que a superexpressão de Ins5Pase AtP5PII sob o controle de um promotor induzível resultou na redução do acúmulo de IP3 em resposta ao tratamento com ABA, anulando a expressão de genes ABA-responsivos como RD29A, KIN2 e RD22. Esses resultados evidenciam que a geração de IP3 ABA-induzido contribui para a expressão desses genes. Em conjunto, esses estudos indicam que a alteração da dosagem de Ins5Pase pode regular os níveis de IP3 estímulo-induzido e afetar a transdução de sinal da qual o ABA participa. Estudos têm confirmado que, no genoma de A. thaliana, existem aproximadamente 15 supostos Ins5Pases; além disso, é provável que diferentes isoformas tenham especificidade para diferentes substratos e/ou localização celular, o que implica em funções distintas na degradação do IP3 gerado em resposta a vários estímulos. Isso indica claramente o papel de Ins5Pases na regulação dos níveis de inositol fosfato mostrado em mutantes e na perda de função em ins5pase (SANCHEZ; CHUA, 2001; XIONG et al., 2001b).

Em um screening genético, que empregou luciferase como repórter sob controle de um promotor de RD29A (CHINNUSAMY et al., 2002; XIONG et al., 2001b), isolou-se uma planta de A. thaliana mutante fiery (fry 1) que exibiu aumentado indução de genes estresse-responsivos sob temperaturas baixas, deficit hídrico, salinidade e tratamento com ABA. A clonagem posicional de FRY 1 revelou que esse gene codifica uma enzima bifuncional que contém atividade de 3(2),5-bifosfato nucleotidase e de Ins1Pase. O FRY 1 é idêntico ao SAL 1, gene que foi isolado pela sua habilidade de conferir aumento na tolerância à salinidade, quando expresso em levedura (XIONG et al., 2002b). Pelo fato de o mutante fry 1 não mostrar sintomas de deficiência ao enxofre, a atividade de 3(2),5-bifosfato nucleotidase de FRY 1, que funciona em assimilação de enxofre, parece dispensável. Portanto, sugeriu-se a hipótese de que mudanças na atividade de Ins1Pase foram responsáveis pelo aumento da expressão gênica em mutantes fry 1, em resposta ao estresse e ao tratamento com ABA (XIONG et al., 2001b). Com os resultados desses estudos, questiona-se se a degradação de IP3 em plantas ocorre via 5-fosfatase ou via 1-fosfatase, ou, ainda, por meio de ambas, e qual seria a contribuição de cada via na sinalização. As vias propostas para degradação de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) em plantas estão representadas na Figura 2.

Figura 2

Figura 2. Via potencial para degradação de IP3 em plantas. As vias são desenhadas sobre informações de sistemas animais. O FIERY1 inositol polifosfato 1 fosfatase pode hidrolisar Ins(1,4) P2 e Ins(1,4,5) P3.

Fonte: adaptado de Xiong et al. (2002b).

Evidências acumuladas sugerem também que a fosfolipase D (PLD) esteja envolvida na transdução de sinais de estresse. A PLD hidrolisa fosfolipídeos para gerar ácido fosfatídico (PA), outro mensageiro secundário em células animais que pode ativar PI-PLC e proteína kinase C (ENGLISH, 1996). O PA funciona também como mensageiro em plantas (WANG, 1999). Em protoplasto de células-guarda, a atividade de PLD medeia o fechamento estomático induzido por ABA (JACOB et al., 1999). O estresse hídrico e a hiperosmolaridade ativam a PLD e conduzem a aumentos transientes dos níveis de PA em plantas (KATAGIRI et al., 2001). A PLD parece ser ativada por estresse osmótico por meio de uma proteína-G (FRANK et al., 2000), independentemente do ABA (KATAGIRI et al., 2001). Todavia, o excesso na atividade de PLD pode afetar negativamente a tolerância da planta ao estresse. O PA é um lipídeo de camada não dupla que favorece a formação da fase hexagonal e pode desestabilizar a membrana em altas concentrações (WANG, 1999). Estudos têm demonstrado que o aumento na atividade de PLD, induzido por estresse hídrico, foi maior em plantas sensíveis do que em genótipos de feijoeiro tolerantes à seca (EL MAAROUF et al., 1999), sugerindo que a elevada atividade de PLD pode colocar em risco a integridade da membrana. Consistente com essa observação, um mutante de A. thaliana deficiente em PLD apresentou-se mais tolerante ao estresse por frio (XIONG et al., 2002b).

Outro ponto bastante discutido no meio científico refere-se ao acúmulo de espécies reativas de oxigênio (ROS) – como superóxido, peróxido de hidrogênio e radicais hidroxila – em células vegetais submetidas aos estresses hídrico e salino, bem como ao frio (HASEGAWA et al., 2000). Essas ROS podem constituir sinais que induzem agentes protetores contra ROS e outros mecanismos de defesa (XIONG et al., 2002b). O ABA tem sido mostrado para induzir a síntese de H2O2 (PEI et al., 2000), e isso tem levado alguns autores a crer que ROS podem constituir-se em sinais intermediários ao ABA na mediação da expressão do gene Catalase 1 (CAT1) (GUAN et al., 2000), na termotolerância (GONG et al., 1998), na ativação de canais de Ca2+ em células-guarda (PEI et al., 2000), no fechamento estomático (ZHANG et al., 2001) e na biossíntese de ABA (ZHAO et al., 2001). Está claro que ROS contribuem para o estresse, e isso foi evidenciado por estudos que utilizaram plantas transgênicas superexpressando agentes protetores contra ROS ou mutantes com elevada habilidade para se proteger de ROS. Essas plantas mostraram tolerância aumentada a estresses ambientais (KOCSY et al., 2001). Embora a conexão entre ROS e a transdução de sinal no estresse osmótico esteja em fase de emergência (ZHU, 2002), o envolvimento de ROS na interação planta-patógeno está bem documentado.

Não está claro se o estresse osmótico conduz ao aumento dos níveis de ácido salicílico (SA) em plantas, mas observações evidenciam que ambos levam ao aumento da atividade da mesma MAPK (HOYOS; ZHANG, 2000). Isso sugere que a transdução de sinal no estresse osmótico e em SA pode compartilhar pontos comuns nessa via. Estudos que empregaram A. thaliana transgênica expressando o gene salicylate hydrolylase (NahG) (BORSANI et al., 2001) demonstraram que plantas deficientes em SA são mais tolerantes ao estresse salino e osmótico. Isso sugere que a tolerância aumentada para o estresse osmótico pode resultar do decréscimo da geração de ROS mediado por SA em plantas que expressam NahG.

Alguns genes relacionados à sinalização ao estresse osmótico têm demonstrado que também são induzidos por estresse oxidativo, incluindo o fator transcricional DREB2A e uma histidina kinase. Não há relatos de que outras histidinas kinases, como ATHK1, que estão potencialmente envolvidas na transdução de sinal ao estresse osmótico, sejam reguladas por estresse oxidativo (URAO et al., 1999). Em células animais e em estudos que usam levedura como modelo, os resultados sugerem que a histidina kinase que atua como osmossensor também medeia a sinalização de ROS (ZHU, 2002). Em culturas de células de A. thaliana, demonstrou-se que AtMPK6 tanto pode ser ativado por baixas temperaturas e por estresse osmótico, como também por estresse oxidativo (YUASA et al., 2001). Desse modo, é provável que módulos de MAPK mediadores na transdução ao sinal de estresse osmótico possam também servir como sinalizadores de ROS em plantas.

Papel do Ca2+ na célula
após a percepção do estresse

O íon Ca2+ está estabelecido como um mensageiro secundário em plantas. Aumentos na concentração citosólica de Ca2+ estão ligados a diversas vias de sinalização e a respostas a estresses bióticos e abióticos. Sistemas de sinalização dependentes de Ca2+ constituem-se dos seguintes componentes: um receptor; um sistema para elevação da concentração de Ca2+ citosólico; componentes a jusante (downstream), que são capazes de reagir para aumentar a concentração de Ca2+ citosólico; além de outros sistemas celulares responsáveis pelo retorno dos níveis Ca2+ ao nível de pré-estímulo. Essa exposição aparentemente simples oculta considerável complexidade. A jusante do aumento da concentração de Ca2+ citosólico, a célula possui arranjos de proteínas que podem responder às mudanças na concentração de Ca2+, bem como calmodulina (CaM), proteínas kinases dependentes de Ca2+ (CDPKs) e proteínas de ligação à CaM (ZHU, 2002).

A despolarização da membrana é uma resposta frequentemente observada em estresses bióticos e abióticos e estímulos que conduzem à elevação dos níveis de Ca2+ citosólico, sugerindo o envolvimento de canais de Ca2+ ativados por despolarização (DACCs) (WHITE, 1998). Esses canais têm sido descritos em vários tipos de células, bem como em raízes de Arabidopsis (THION et al., 1998). Sua atividade parece ser negativamente regulada pelos microtúbulos. Todavia, não estão disponíveis informações muito consistentes sobre sua regulação ou registros que confirmem a relação direta entre a atividade de DACC e a elevação da concentração de Ca2+. Especialistas argumentam sobre a dificuldade na caracterização desses canais, embora isso seja possível por meio da despolarização ou da desorganização de microtúbulos (THION et al., 1998). A identidade de DACCs ainda não foi identificada em plantas. Propõe-se que o gene AtTPC 1 de Arabidopsis, que possui alta homologia com a subunidade α 1 de um canal de Ca2+ dependente de voltagem em células animais, seja candidato a receptor de estímulo para o funcionamento desse canal em plantas; entretanto, estudos adicionais serão necessários para caracterização funcional desses canais.

Os sensores de Ca2+ podem ser classificados dentro de duas classes: sensores de respostas e sensores de transmissão (SANDERS et al., 2002). No que se refere aos ligantes ao Ca2+, os sensores de respostas alteram sua conformação e modulam sua atividade de reconhecimento ou função por meio de interações intramoleculares. Em plantas, o exemplo mais bem caracterizado refere-se às proteínas kinases dependentes de Ca2+ (CDPKs) (HARMON et al., 2001). Essas proteínas possuem domínios ligando a kinases e a calmodulinas por meio de uma única proteína, e permitem sua ativação direta pelo Ca2+. De outro modo, os sensores de transmissão, como a calmodulina, comunicam a mudança conformacional para permitir interação com kinases, resultando em alteração na atividade dessas kinases. Inúmeros mecanismos têm sido propostos por conta da amplitude de papéis do Ca2+ na sinalização em plantas, bem como pela especificidade resultante desses sinais. O potencial para os diferentes sensores na contribuição para especificidade funcional é magnificado pela presença de famílias de proteínas como as kinases.

Sob estresses abióticos, foco em questão, a via de sinalização refere-se à existência das proteínas kinases dependentes de Ca2+ (CDPKs). Essas proteínas são serina/treonina kinases que contêm um domínio C-terminal semelhante ao da calmodulina e com motivos que podem se ligar diretamente ao Ca2+. Outras kinases possuem miristoilação, o que sugere associação com membranas celulares. O genoma de A. thaliana codifica ao menos 34 supostas CDPKs (HRABAK et al., 2003). Estudos têm mostrado que as CDPKs são induzidas ou ativadas por estresses abióticos. Isso sugere que elas podem estar envolvidas na sinalização ao estresse. Em plantas de arroz, uma CDPK associada à membrana foi ativada pela exposição ao frio (MARTIN; BUSCONI, 2000). Ademais, a superexpressão de OsCDPK7 resultou em aumento da tolerância ao frio e ao estresse osmótico em arroz (SAIJO et al., 2000). Desse modo, CDPKs demonstram envolvimento na transdução de sinais para tolerância de plantas a estresses. Isso se torna mais evidente em experimentos nos quais uma AtCDPK1 ativa induziu a expressão de um gene repórter dirigido pelo promotor de HVA1, responsivo ao estresse, em protoplastos de células foliares de milho (SHEEN, 1996). De modo interessante, uma proteína fosfatase do tipo 2C (AtPP2CA) pode bloquear a ativação de AtCDPK1 reduzindo a expressão do gene repórter sob controle de HVA (SHEEN, 1996). Não está claro se AtPP2CA age diretamente sobre AtCDPK1 ou modula cascatas de fosforilação a jusante (downstream). Estudos efetuados por Tähtiharju e Palva (2001) geraram plantas de Arabidopsis AtPP2CA-silenciadas e encontraram indução aumentada de CBF1, RAB18, RCI2A e RD29A submetidas ao frio e ou ao tratamento com ABA. Esses transgênicos exibiram alto grau de tolerância ao frio.

Existe muita ambiguidade no que diz respeito ao papel desempenhado pelas CDPKs na transdução de sinal ao estresse, especialmente, com relação à forma com que se conectam às unidades de sinalização. Verificou-se que uma CDPK foi induzida em resposta à infecção por patógeno (ROMEIS et al., 2000). Entretanto, a sua relação com vias MAPK ativadas sob estresses ainda não está clara. Resultados obtidos em estudos que utilizaram levedura como organismo-modelo também não apresentaram grandes esclarecimentos sobre a conexão entre proteínas de ligação ao Ca2+ e vias MAPK. Em outro estudo sobre células neurais, os resultados obtidos sugerem que a calmodulina percebe alterações locais nos níveis de Ca2+ e ativa uma via MAPK com o objetivo de regular a expressão de genes-alvo (DOLMETSCH et al., 2001), embora o ponto de conexão entre calmodulina-Ca2+ e a via MAPK permaneça indefinido. Em plantas, resultados interessantes foram obtidos pela observação de uma CDPK com a proteína (CSP1) interagente. A CSP1 constitui um dos componentes reguladores de resposta que poderia servir como ativador transcricional, sugerindo um papel potencial para CDPK no envio direto de informação para o núcleo, o que proporciona a expressão de genes-alvo.

Estudos recentes têm apresentado progressos na caracterização das famílias de sensores salt overly sensitive (SOS3) e em sua família de kinases associada (SOS2). Estudos genéticos, moleculares e bioquímicos suprem evidências de que essas duas famílias de proteínas interagem de forma diferenciada para formar complexos que funcionam em vias de sinalização, em Arabidopsis, em resposta a estresse abiótico (GONG et al., 2004). Componentes da via de transdução de um sinal ao Ca2+ induzido por estresse, visando restaurar a homeostase celular, estão representados na Figura 3 (ZHU, 2002).

Figura 3

Figura 3. Representação da regulação da homeostase iônica pela via SOS durante estresse salino. Sinais de Ca2+ são percebidos por SOS3 que ativa a kinase SOS2. O complexo kinase gerado SOS3-SOS2 regula os níveis celulares de Na+ pelo estímulo ao transporte de Na+ para fora do citoplasma (por exemplo, pelo aumento da expressão e atividade de SOS1) e pela restrição à entrada de Na+ para o interior do citoplasma (por exemplo, pela inibição da atividade de HKT1). Um alvo adicional da kinase SOS2, a NHX (trocador vacuolar de Na+/H+), também contribui para a homeostase iônica celular por transportar Na+ do citoplasma para dentro do vacúolo.

Fonte: adaptado de ZHU (2002).

A sequência de aminoácidos de SOS3 está estreitamente relacionada à subunidade regulatória de calcineurina (CNB) de levedura e a sensores neurais de cálcio em animais (LIU et al., 2000; ZHU et al., 1998). Uma mutação de perda de função em Arabidopsis no gene SOS3 resulta em plantas hipersensíveis à salinidade. Curiosamente, o fenótipo hipersensível mutante sos3 pode ter sua tolerância parcialmente restaurada pelo aumento da concentração de Ca2+ no meio de crescimento. Portanto, SOS3 pode ser parte da base molecular no fenômeno observado, participando da(s) via(s) que leva(m) à tolerância da planta ao estresse (ZHU, 2000).

Estudos têm demonstrado que o motivo EF-hand presente em SOS3 liga-se ao Ca2+ com menor afinidade quando comparado à calmodulina (ISHITANI et al., 2000). Segundo o autor, uma mutação SOS3 que ocorre sobre o motivo EF-hand leva à redução da habilidade de ligação da proteína ao Ca2+. A baixa afinidade de ligação de SOS3 sugere que a função de SOS3 na tolerância à salinidade pode ser executada em uma localização celular específica, na qual aumentos transientes de Ca2+ são muito grandes. SOS3 é miristoilado in vivo, evento requerido para sua função na tolerância à salinidade. O gene SOS2 codifica para uma proteína kinase serina/treonina, que também funciona na tolerância à salinidade em Arabidopsis (LIU et al., 2000). SOS2 possui um domínio catalítico N-terminal similar a um AMP ativado por kinases (AMPK), além de um novo domínio regulatório C-terminal. SOS3 tem sido mostrado para interagir com SOS2 (HALFTER et al., 2000). Além disso, SOS3 ativa SOS2 de maneira dependente de Ca2+, e análises em mutantes duplos sos3/sos2 indicam que SOS3 e SOS2 participam da mesma via (HALFTER et al., 2000). O primeiro alvo da via regulatória SOS3-SOS2 é o transportador do tipo antiporte codificado pelo gene SOS1. A expressão de SOS1 durante estresse salino é, parcialmente, controlado por SOS3 e SOS2 (SHI et al., 2000), e a ativação de SOS1 Na+/H+, transportador antiporte, requer SOS3 e SOS2 (QIU et al., 2001). A coexpressão de SOS1, SOS2 e SOS3 aumenta drasticamente a tolerância ao estresse salino em mutantes de levedura nos quais todos os transportadores de Na+ foram removidos (QUINTERO et al., 2002). O complexo kinase SOS3-SOS2 fosforila e ativa a expressão de SOS1 em levedura, aumentando a exclusão de Na+ e, consequentemente, permitindo maior tolerância a NaCl (QUINTERO et al., 2002). Ademais, estudos utilizando Arabidopsis como modelo, evidenciam que a superexpressão de SOS1 ou de mutantes com expressão constitutiva de SOS2 melhoram a tolerância ao estresse salino (SHI et al., 2003). Esse fato sugere que a excessiva coexpressão de SOS1, SOS2 e SOS3 pode aumentar drasticamente a tolerância de plantas à salinidade.

Atualmente é intenso o debate sobre a significância das oscilações citosólicas da concentração de Ca2+ e da sua transitoriedade. Em células animais, as evidências sugerem a hipótese de que a informação pode ser codificada pelas oscilações do Ca2+ citosólico (BERRIDGE et al., 2003). Entretanto, em plantas sugere-se que essas oscilações nos níveis citosólicos desse íon, bem como sua transitoriedade, podem codificar informações que auxiliam na determinação da natureza de respostas a jusante (downstream) (SCHROEDER et al., 2001). Atualmente, aumentam-se as evidências de que as oscilações transientes de Ca2+ citosólico podem ser responsáveis por codificar informações específicas em células-guarda. Estudos desenvolvidos evidenciam que é possível correlacionar o padrão de oscilação do Ca2+ citosólico com a intensidade do estímulo externo e a extensão da resposta final, por exemplo, no fechamento estomático (MCAINSH et al., 1995). Todavia, esses dados revelaram uma taxa de correlação maior que a evidência suprida de uma relação causal entre oscilações citosólicas de Ca2+ e controle da abertura estomática. Outros estudos estabeleceram uma ligação maior entre oscilações de Ca2+ e controle da abertura estomática usando mutantes det3 de Arabidopsis, os quais exibem uma redução de 60% na expressão da subunidade C de uma H+-ATPase tipo V (ALLEN et al., 2000). A hipótese dos autores é de que a redução da atividade de H+-ATPase tipo V pode resultar na redução do sequestro de Ca2+ a partir de estoques internos e, consequentemente, afetar as oscilações estímulo-induzido. O efeito preciso da redução na expressão de DET3 foi observado pelos autores, os quais constataram que, em contraste com as células-guarda do tipo selvagem, as do mutante det3 falharam para exibir oscilações citosólicas de Ca2+ e redução no turgor de células-guarda em resposta a 1 mM de Ca2+ e 10 mM de Ca2+ externo. O tempo para máximo acúmulo de Ca2+ nas células do tipo selvagem foi de aproximadamente 30 minutos, enquanto para as mutantes det3 esse tempo foi significativamente maior. Esses resultados demonstram claramente que o motivo que levou os mutantes a falharem no fechamento estomático em resposta à concentração externa de Ca2+ não pode ser atribuído à inabilidade de aumento na concentração de Ca2+ citosólico, mas sim à incapacidade de gerar oscilações na sua concentração de forma mais rápida. Em outro estudo, demonstrou-se que a indução experimental de oscilações de Ca2+ citosólico conduz ao resgate parcial do fechamento estomático em mutantes det3 (ALLEN et al., 2000). Após as evidências para a importância das oscilações do Ca2+ na sinalização das células-guarda, o próximo desafio será esclarecer qual é o seu papel específico no controle da abertura estomática. É possível que as oscilações sejam responsáveis por estabilizar o estado de baixo turgor celular enquanto a protegem de presumíveis efeitos deletérios pela exposição prolongada sob níveis elevados desse íon (MCAINSH et al., 1995).

Ao analisar os resultados obtidos nesses estudos, torna-se claro que fatores adicionais devem ser considerados antes de qualquer generalização sobre o papel desempenhado pelas oscilações de Ca2+ citosólico nas células-guarda. Deve-se considerar que ABA, CO2- e H2O2 podem levar ao fechamento estomático na ausência de oscilações da concentração de Ca2+ (WEBB et al., 1996). É possível, também, que os experimentos não tenham sido longos o suficiente para permitir que o estômato reagisse ao steady state e, desse modo, exibissem oscilações na concentração de Ca2+ citosólico.

Em resumo, as oscilações transientes de Ca2+ são encontradas em diferentes células de plantas e seus mecanismos de geração e possível significância fisiológica têm sido alvo de muitas pesquisas. Embora as pesquisas tenham avançado consideravelmente com relação à origem das oscilações de Ca2+, maiores dificuldades têm sido encontradas na determinação do seu papel fisiológico. Entretanto, a identificação de novos mutantes para via de sinalização e a manipulação de componentes da homeostase do Ca2+ provavelmente irão conduzir a um maior esclarecimento a respeito das possíveis funções para as oscilações de Ca2+ e das mudanças citosólicas transientes.

Estresse por deficiência hídrica

Entre as condições de estresse presentes, a deficiência hídrica pode afetar o crescimento da planta e reduzir seu rendimento. Períodos de baixa intensidade pluviométrica ou veranicos prolongados podem conduzir à condição meteorológica denominada seca. As plantas, no entanto, podem responder a esse fator imposto, e a eficiência desse sistema complexo de defesa pode determinar o sucesso da espécie em ambientes estressantes. Sob condições ambientais desfavoráveis, respostas de plantas em nível celular e molecular têm sido intensamente estudadas. A compreensão dos mecanismos pelos quais as plantas percebem e transmitem esses sinais ambientais para a maquinaria celular, visando às respostas de aclimatação, é fundamental para que os fisiologistas e biologistas moleculares possam, em trabalho conjunto, obter plantas com capacidade aumentada para tolerar condições estressantes que naturalmente ocorrem no ambiente.

Sob deficiência hídrica, a planta pode desencadear respostas que irão determinar sua sobrevivência e reprodução. Entre essas respostas, incluem-se os mecanismos de controle estomático e de maximização da absorção de água, por meio do crescimento de raízes e do ajuste osmótico. Entretanto, como abordado no tópico anterior, informações sobre a existência e a regulação de sensores primários que podem perceber as mudanças na disponibilidade de água são ainda muito escassas, e informações mais concretas são obtidas com a utilização de bactérias e de levedura que são organismos que servem de modelo para esse estudo. Em A. thaliana e em tabaco, têm sido obtidas as primeiras evidências da existência desses sensores, mas estudos adicionais ainda são necessários para melhor compreensão, tendo em vista que ainda não são dados conclusivos.

O papel desempenhado pelo ABA na tolerância ao estresse abiótico, especialmente à deficiência hídrica, tem sido bastante discutido. Esse ponto está sendo bem ilustrado pela obtenção de plantas mutantes deficientes em ABA. O emprego da genética reversa e de screen para obtenção de mutantes em larga escala tem auxiliado na compreensão dos mecanismos, por meio dos quais o ABA exerce seu papel na regulação da tolerância de plantas ao estresse em questão.

Tem sido verificado que, durante estresses bióticos e abióticos, as plantas aumentam a síntese desse hormônio. O envolvimento do ABA em resposta de plantas ao estresse tem sido reconhecido há algum tempo. Todavia, a extensão e as bases moleculares do envolvimento do ABA na expressão gênica estresse responsivo não foram clareadas imediatamente. Estudos acerca da relação entre ABA e diferentes vias de sinalização ao estresse têm aumentado significativamente pela obtenção de mutantes. Para facilitar os screens genéticos em mutantes sinalizadores de estresse, transgênicos de A. thaliana estão sendo engenheirados. Além disso, têm sido empregados genes repórteres, como luciferase (LUC) sob controle do promotor (RD29A), o qual contém ambos os elementos responsivos ao ABA: ABA-responsive element (ABRE) e dehydration responsive element (DRE/CRT). Sementes de plantas transgênicas RD29A-LUC foram submetidas a ethyl methanesulfonate ou T-DNA para obtenção de mutantes. Os mutantes obtidos foram desenhados para apresentarem resposta alterada (intensidade de luminosidade – quando expresso RD29A-LUC) ao deficit hídrico e ao tratamento com ABA (ISHITANI et al., 1997). Comparadas com plantas do tipo selvagem, plantas RD29A-LUC mutantes exibiram expressão constitutiva (cos), alta (hos) ou baixa (los) em resposta a vários estresses ou tratamento com ABA. A ocorrência de mutações com diferentes níveis de respostas ao estresse ou ABA revelou a existência de uma rede complexa de transdução de sinal e sugere que exista extensiva conexão entre estresses por frio, deficiência hídrica, salinidade e ABA (ISHITANI et al., 1997). A caracterização e a clonagem de algumas dessas mutações têm provido nova compreensão sobre os mecanismos de transdução de sinal ao ABA.

A comunidade científica tem buscado atualmente esclarecer vias de respostas dependentes e independentes de ABA. Atualmente, têm sido obtidos avanços pela identificação de receptores solúveis e pela compreensão estrutural referente a mecanismos de percepção e sinalização ao ABA. Os estresses por salinidade, deficit hídrico e frio causam incrementos na biossíntese e acúmulo de ABA, o que pode rapidamente ser catabolizado quando os níveis de estresse são reduzidos (WEINER et al., 2010). Muitos genes responsivos ao deficit hídrico são induzidos por ABA (WEINER et al., 2010). O papel do ABA na transdução de sinal ao estresse osmótico foi previamente definido pelo estudo da indução de vários genes em plantas mutantes de A. thaliana deficientes em ABA (aba1-1) e ABA insensível (abi-1-1 e abi2-2). A conclusão geral desses estudos demonstrou que, em temperaturas baixas, a expressão gênica é relativamente independente de ABA, enquanto sob estresse osmótico pode ser ativada por meio de ambas as vias: ABA dependente e ABA independente (SHINOZAKI; YAMAGUCHI-SHINOZAKI, 2000). Em um screening genético, um grupo de mutantes com expressão reduzida de RD29A-LUC submetido a estresse osmótico foi recuperado. Dois dos locos definidos por esses mutantes, LOS5 e LOS6, têm sido caracterizados e os genes isolados. Em LOS5, a expressão de vários genes responsivos ao estresse hídrico, tais como RD29A, COR15, COR47, RD22 e P5CS, foi severamente reduzida ou completamente bloqueada sob estresse salino (XIONG et al., 2001a). Interessantemente, plantas LOS5 são defectivas na biossíntese de ABA quando submetidas ao deficit hídrico. Por meio da clonagem molecular, revelou-se que LOS5 codifica um cofator molibdênio sulfurase (MCSU) e é alélico para ABA3 (XIONG et al., 2001a). O lócus ABA3 foi definido previamente por mutantes aba3-1 e aba3-2 (LÉON-KLOOSTERZIEL et al., 1996) e recentemente por outro alelo, o frs1-1 (LLORENTE et al., 2000). Quando ABA exógeno foi aplicado, a indução de RD29A-LUC em resposta ao estresse osmótico foi restaurada, demonstrando que a deficiência de ABA foi responsável pelo defeito na regulação da expressão gênica em resposta ao estresse osmótico. Essa descoberta sugere que a indução desses genes responsivos ao estresse osmótico seja inteiramente dependente de ABA. Similarmente, no mutante los6, os genes RD29A, COR15A, KIN1, COR47, RD19 e ADH foram menos expressivos do que nas plantas do tipo selvagem (XIONG et al., 2002a). Plantas los6 são também defectivas na biossíntese de ABA em resposta ao deficit hídrico. Análises genéticas mostraram que los6 é alélico ao aba1 e codifica para zeaxantina epoxidase (ZEP) (XIONG et al., 2002a).

A caracterização dos mutantes los5 e los6 tem revelado um papel crítico para o ABA na mediação da expressão gênica em resposta ao estresse osmótico. Pelo fato de a deficiência parecer não afetar significativamente a expressão de DREB2A (que codifica para um fator transcricional específico em resposta à deficiência hídrica), é proposto que a sinalização por ABA possa ser requerida para regular a atividade de DREB2A ou possa estar associada à ativação da classe de genes DRE (XIONG et al., 2001a). Esse nível de interação entre sinalização do ABA e sinalização ao estresse osmótico forma a base da interação sinergística entre ABA e estresse osmótico na ativação da expressão de genes responsivos ao estresse (XIONG et al., 2001a).

Sob deficit hídrico, salinidade, frio e ABA, os genes representados na Figura 4 podem ser ativados por meio de fatores de transcrição induzíveis, bem como CBF/DREB1 e DREB2, e fatores transcricionais bZIP ABA-induzíveis (ABF/AREB) (SHINOZAKI; YAMAGUCHI-SHONOZAKI, 2000). Um ativador transcricional não identificado, inducer of CBF expression (ICE), é indicado nessa representação esquemática (THOMASHOW, 1999). IP3 está envolvido na sinalização, como revelado por identificação genética do lócus FRY1, que regula negativamente os níveis de IP3 e sinalizadores de estresse (XIONG et al., 2001b). O lócus HOS1 regula negativamente a sinalização ao frio, presumivelmente atingindo ICE ou como componente de sinalização a jusante (upstream) para degradação (LEE et al., 2001). A ativação de genes mediada por DREB2 também depende de modificações pós-transcricionais e transducionais de CBF/DREB1ABA-dependente, ou DREB2, ou por meio de coativadores associados (indicado com setas tracejadas no esquema da Figura 4). COR, regulado por frio; KIN, induzido por frio; LTI, induzido por baixas temperaturas; RD, responsivo a desidratação, encontram-se expostos nessa representação esquemática.

Figura 4

Figura 4. Representação para vias de ativação de genes da classe LEA responsivos a estresses com cis-elementos DRE/CRT e ABRE.

Fonte: adaptado de Xiong et al. (2002b).

A regulação de genes envolvidos na via de biossíntese do ABA tem sido estudada. O aumento nos níveis de ABA sob estresse por deficit hídrico e salino está muitas vezes relacionado à indução de genes que codificam para enzimas chaves que catalisam a reação de biossíntese desse hormônio. A via de biossíntese do ABA em plantas superiores é compreendida em grande parte (Figura 5) (MILBORROW, 2001). ZEP (codificada por ABA1 e ABA2 em tabaco) catalisa a epoxidação de zeaxantina e anteraxantina para violaxantina. A 9-cis-epoxicarotenoide dioxigenase (NCED) catalisa a clivagem oxidativa de 9-cis-neoxantina para gerar xantoxina. A conversão de xantoxina a ABA ocorre por meio de dois passos na via ABA-aldeído. Mutantes aba2 de A. thaliana são debilitados no primeiro passo dessa reação. Desse modo, torna-se inábil para converter xantoxina a ABA-aldeído (LÉON-KLOOSTERZIEL et al., 1996). Mutantes aba3 são defectivos na última etapa de biossíntese do ABA, na etapa de conversão de ABA-aldeído para ABA (BITTNER et al., 2001), que é catalisada por ABA-aldeído oxidase (AAO). Mutações em qualquer aldeído oxidase ou mesmo no cofator molibdênio poderiam reduzir a biossíntese de ABA e conduzir a plantas deficientes no que diz respeito a esse hormônio. Nessa via de biossíntese de ABA, o passo limitante foi determinado para ser a clivagem oxidativa da neoxantina catalisada pela enzima NCED (THOMPSON et al., 2000).

Figura 5

Figura 5. Representação da via de biossíntese e regulação de ABA. AAO = ABA-aldeído oxidase; MCSU = molibdênio cofator sulfurase; NCED = 9-cis-epoxicarotenoide dioxigenase; ZEP = zeaxantina epoxidase.

Fonte: adaptado de Xiong et al. (2002b).

Na Figura 5, observa-se que ABA é sintetizado a partir de um precursor β-caroteno via clivagem oxidativa de neoxantina, seguido de dois passos para conversão de xantoxina para ABA via ABA-aldeído. Estresses ambientais, como a seca, a salinidade e, em menor extensão, o frio, estimulam a biossíntese e o acúmulo de ABA em virtude da ativação de genes codificadores de enzimas da rota de biossíntese. A ativação de genes da via de biossíntese do ABA em resposta ao estresse é, provavelmente, mediada por uma cascata de fosfoproteínas dependentes de Ca2+. Além disso, ABA pode estimular, via retroalimentação, a expressão de genes da via biossintética do próprio ABA, evento que poderá ocorrer por meio de cascatas usando uma fosfoproteína dependente de Ca2+ (THOMPSON et al., 2000). A degradação do ABA ao ácido faseico está também representada na Figura 5. A expressão de ZEP, NCED, AAO3 e MCSU indica que esses genes são todos regulados positivamente por deficit hídrico e salinidade (XIONG et al., 2002b), embora seus produtos proteicos não tenham sido examinados em todos os experimentos. A expressão de ZEP (XIONG et al., 2002b), NCED (QIN; ZEEVAART, 1999) e MCSU (XIONG et al., 2001b) não é, obviamente, regulada por frio, o que é consistente com o baixo ou nenhum aumento no conteúdo de ABA em plantas submetidas a esse fator de estresse.

ABA está envolvido na ativação de enzimas que funcionam no catabolismo de ABA. De fato, a atividade de ABA 8’-hidroxilase, que catalisa o primeiro passo da degradação do ABA, foi estimulada por ABA exógeno. Todavia, não há resultados conclusivos sobre a catálise de ABA e sobre como ocorre a regulação, por ABA, de genes envolvidos na sua biossíntese. Curiosamente, com exceção dos NCEDs, cuja expressão não é significativamente induzida por tratamento com ABA (XIONG et al., 2001a), as demais, como ZEP (LOS6/ABA1), AAO3 e MCSU (LOS5/ABA3), são todas reguladas positivamente por ABA (XIONG et al., 2002b). Isso sugere que a regulação positiva por feedback da via de biossíntese do ABA, pelo próprio ABA, pode existir, surgindo como novo mecanismo de adaptação ao estresse em virtude do fato de poder, rapidamente, estimular biossíntese adicional de ABA por meio desse feedback positivo. Essa retroalimentação é positivamente regulada por SAD1 (supersensível ao ABA e ao deficit hídrico), de modo que a mutação em sad1 conduz ao empobrecimento da regulação de ABA pelos genes AAO3 e MCSU (XIONG et al., 2001b). Ademais, em mutantes abi1 insensíveis, esse feedback é parcialmente empobrecido, mas não é afetado em abi2 (XIONG et al., 2002b). A observação de que espécies reativas de oxigênio (ROS) podem mediar tanto a sinalização quanto a biossíntese de ABA (ZHAO et al., 2001) sugere que a regulação por feedback de genes da via de biossíntese do ABA pelo ABA possa ser mediado, em parte, por ROS por meio de uma cascata de fosforilação proteica (Figura 5). A significância dessa regulação por feedback na biossíntese do ABA sob estresses abióticos precisa ser pesquisada em estudos futuros. Assumindo que esse feedback seja importante na regulação global na via de biossíntese do ABA, o fato de NCEDs não serem reguladas positivamente por ABA, ou serem fracamente reguladas, é consistente com a noção de que NCED catalisa um passo limitante na biossíntese. Entretanto, as observações a respeito do fato de que a superexpressão de um dos genes da via de biossíntese conduziu ao aumento de ABA e da tolerância à seca (ZHU et al., 2005) sugerem que a síntese de ABA é coordenadamente controlada em múltiplos passos. De forma alternativa, isso pode resultar de regulação positiva de genes envolvidos na biossíntese do ABA, pelo próprio ABA, pelo fato de ser observado que há, inicialmente, um aumento limitado nos níveis de ABA pela expressão de um único gene que pode resultar no incremento coordenado de indução de outros genes envolvidos na biossíntese desse hormônio (XIONG et al., 2002b).

Os mecanismos pelos quais estresses por deficit hídrico ou por salinidade regulam genes na via biossintética de ABA ainda não estão bem compreendidos. Estudos recentes sugerem que todos esses genes (por exemplo, ZEP, NCED, AAO3 e MCSU) sejam provavelmente regulados por meio de uma cascata de sinalização comum e dependente de Ca2+.

O emprego de técnicas de biologia molecular tem focado também a regulação de genes responsivos ao estresse que independem de ABA. A expressão desses genes é regulada por meio de cis-elementos DRE, enquanto a via ABA dependente ativa a expressão gênica por meio de cis-elementos ABRE. Na via ABA independente, durante a sinalização por estresse osmótico, o fator transcricional AP-2, DREB2A e DREB2B, transativa os cis-elementos DRE. Todavia, a clonagem e as análises transgênicas de um fator transcricional CBF4 de A. thaliana, que é tido como um DREB1-relacionado, mostrou que a regulação de elementos DRE pode também ser mediada pela via ABA dependente. A expressão do gene CBF4 é positivamente regulada por estresse hídrico e por ABA, mas não por frio. A superexpressão de CBF4 em A. thaliana resultou em expressão constitutiva de CRT/DRE que contém genes responsivos a estresses e aumentou a tolerância à seca e ao frio (HAAKE et al., 2002).

Em A. thaliana, genes responsivos ao estresse podem ser também regulados por fatores transcricionais que contêm dedos de zinco (STZ e ZAT10) (LEE et al., 2002). Em plantas de Arabidopsis los2, um mutante sensível ao frio possui padrão de expressão reduzida sob frio, mas isso não ocorre sob estresse por salinidade e deficiência hídrica. Entretanto, nenhuma diferença foi observada na expressão de CBF entre los2 (mutante sensível ao frio) e o tipo selvagem. Estresse por frio regula positivamente LOS2, que codifica para uma enolase que é localizada no citoplasma e no núcleo. Em células animais, enolase funciona como um repressor transcricional do gene c-myc. Estudos evidenciam que, em Arabidopsis, LOS2 liga-se ao elemento promotor de STZ/ZAT10. A expressão de STZ/ZAT10 é induzida rapidamente e transientemente por frio em plantas do tipo selvagem, e essa indução é muito forte e persistente em plantas mutantes los2 (LEE et al., 2002), sugerindo que LOS2 age como repressor de STZ/ZAT10 durante estresse por frio. Desse modo, proteínas estresse-responsivas agem como efetores do frio, do deficit hídrico e da tolerância à salinidade, mas diferentes vias de sinalização controlam a expressão de genes responsivos ao estresse durante o frio e o estresse osmótico. Os componentes de ambas as vias de sinalização, dependentes e independentes de ABA, que ativam os fatores de transcrição, necessitam ser geneticamente definidos e ordenados para que seja possível determinar se uma via de sinalização é específica para um determinado estresse ou está envolvida em conversa cruzada (cross-talk) com outras vias. O emprego de estudos bioquímicos e fisiológicos, da genética reversa e a obtenção de mutantes em larga escala poderão propiciar maior elucidação dessas vias e, especialmente, preencher lacunas atualmente existentes, as quais se referem à determinação dos sensores primários em plantas e em seu funcionamento.

Estresse térmico

Quando há incapacidade de locomoção como meio de resposta às oscilações térmicas, as plantas precisam responder de outra forma. A variação térmica no ambiente onde estão expostas pode ser muito rápida e pode variar tanto no espaço quanto no tempo, sob diferentes escalas. Por exemplo, em regiões próximas à Linha do Equador, as plantas podem experimentar temperaturas máximas diurnas de até 60 ºC. Na região oriental da Sibéria, por sua vez, as temperaturas podem variar de 30 ºC no verão a -70 ºC no inverno. Portanto, durante o ano, a planta pode experimentar uma amplitude de variação da ordem de 100 ºC.

O arroz é um exemplo de sucesso no que diz respeito à obtenção de genótipos de clima subtropical cultivados em regiões temperadas. Os cientistas buscam compreender os mecanismos de percepção e de transdução de sinal que as plantas utilizam para responder às variações térmicas ocorrentes e, assim, estender a amplitude de cultivo de plantas. Da mesma forma que ocorre com o estresse por deficiência hídrica, existem poucas informações acerca de como as plantas percebem as variações térmicas (sensores primários) e traduzem esse sinal em vias de transdução de sinal ao estresse. Como reportado no item Sensores a estresses abióticos, informações mais consistentes obtidas até então, originaram-se de bactérias e leveduras, como organismos-modelo. Em Bacillus subtilis, uma histidina kinase (HIK33) é tida como um possível termossensor (AGUILAR et al., 2001; SUZUKI et al., 2000). Em Arabidopsis, o gene ATHK1 tem sua expressão aumentada sob estresse por baixa temperatura (URAO et al., 1999). Todavia, são necessários novos estudos que permitam determinar onde se localizam e como funcionam os termossensores primários em plantas. Embora não tenha sido identificado, até o momento, nenhum sensor térmico em plantas (SAMACH; WIGGE, 2005), em Arabidopsis essa questão está sendo muito explorada no intuito de obter tal informação. Tem sido bastante explorada a expressão transiente de proteínas de choque térmico (heat-shock proteins – HSPs). A estrutura primária das HSPs é altamente conservada desde os procariotos até os eucariotos, bem como na alta homologia encontrada entre animais e plantas. Consequentemente, tem sido atribuído a essas proteínas o papel de proteção contra estresse térmico e de manutenção da homeostase celular.

A indução de HSPs depende da temperatura sob a qual cada espécie ordinariamente cresce. Em plantas, HSPs são geralmente induzidas por curtos períodos a temperaturas que variam de 38 ºC a 40 ºC (IBA, 2002). Existem ainda HSPs de variados tamanhos moleculares, que são caracterizadas pela sua capacidade de ligação a proteínas instáveis e desempenham seu papel fisiológico como chaperonas moleculares. Em adição a suas funções no dobramento de proteínas imediatamente após a tradução, elas previnem a agregação de proteínas desnaturadas e promove a renaturação de moléculas proteicas agregadas. Essas funções das HSPs estão profundamente envolvidas na tolerância à temperatura. As HSPs são classificadas dentro de cinco classes, considerando-se as diferenças no seu peso molecular (HSP 100, HSP 90, HSP 70, HSP 60 e HSPs de baixo peso molecular, denominadas smHSPs). Estão localizadas no citoplasma e em organelas, como núcleo, mitocôndria, cloroplastos e retículo endoplasmático.

As smHSPs com peso molecular que varia de 15 kDa a 30 kDa constituem as mais diversas HSPs. Por exemplo, as smHSPs citosólicas com 18,1 kDa identificadas em ervilha previnem a agregação proteica por altas temperaturas (LEE et al., 1997). Tem sido demonstrado que a regulação da expressão gênica para HSPs ocorre, na maioria dos casos, em nível transcricional, e que os fatores de transcrição (HSFs) ativados reconhecem cis-elementos (heat-shock elements; HSEs) localizados em regiões a montante (upstream) da região promotora, induzindo sua transcrição (WU, 1995). Quando um gene HSF foi introduzido em Arabidopsis visando à obtenção de expressão constitutiva de HSP, a termotolerância foi aumentada quando comparada às plantas do tipo selvagem (LEE et al., 1995). Pelo menos uma smHSP localizada no citoplasma foi expressa em Arabidopsis transgênica, sugerindo que smHSPs podem contribuir para a termotolerância em plantas.

Tem sido constatado que os domínios primários de HSP 70 são altamente conservados por meio de diferentes espécies. Estudos detalhados em Escherichia coli, em células animais e em levedura, indicam que HSP 70 funciona como chaperonas moleculares. HSP 70 interrompe a interação dentro das proteínas e entre elas. Um exemplo disso é o fato de se ter verificado sua participação facilitando o transporte de proteínas para a membrana, bem como a ligação ao retículo endoplasmático, ou prevenindo a agregação de proteínas desnaturadas. Em Arabidopsis, a construção de um antissenso para HSP 70 reprime a expressão do gene, e isso resulta em menor termo-tolerância da planta (LEE; SCHÖFFL, 1996.).

Especula-se que HSP 100 e HSP 90 funcionem como chaperonas, embora existam poucas evidências diretas relacionadas a estresse por temperatura em plantas. Todavia, estudos em Arabidopsis têm reportado que em mutantes hot1, deficientes em HSP 101, mostram-se mais suscetíveis a altas temperaturas (HONG; VIERLING, 2000, 2001). Além das proteínas de choque térmico, existem ainda HSPs induzidas por estresse osmótico, salinidade, hipoxia, entre outros. Elas podem desempenhar papéis específicos na proteção da desnaturação de proteínas e no reparo de função, como parte das respostas fisiológicas aos diversos fatores ambientais.

Sob temperaturas baixas, foi constada uma família de genes responsivos ao frio (CBF). A partir de então, tem-se obtido grande avanço na compreensão da tolerância a temperaturas baixas pelo emprego de Arabidopsis como modelo para estudo. Essa planta codifica uma pequena família de ativadores transcricionais responsivos ao frio, conhecidos como CBF1, CBF2 e CBF3 ou DREB1b, DREB1c e DREB1a (NOVILLO et al., 2007). Os fatores transcricionais CBF, que são membros de AP2/EREBP, família de proteínas ligantes a determinadas regiões do DNA, reconhecem sequências regulatórias presentes no DNA, responsivas ao frio e ao deficit hídrico (CRT/ DRE) (Figura 6). Nessa representação esquemática, são dispostos os componentes da via CBF responsivos ao frio e os pontos de conversa cruzada (cross-talk) entre diferentes vias.

Figura 6

Figura 6. Rede regulatória transcricional de genes envolvidos em resposta à baixa temperatura e à desidratação. Fatores transcricionais ABA dependentes são sobrepostos, enquanto fatores independentes de ABA não o são. Pequenos círculos indicam modificações pós-transcricionais, bem como fosforilação. Sítios de ligação de fatores transcricionais são representados por retângulos na parte inferior da figura, com a representação dos promotores listados logo abaixo. Linhas pontilhadas indicam possível regulação. Seta dupla indica possível conversa cruzada ou cross-talk.

Fonte: adaptado de Zhang et al. (2004).

Elementos CRT/DRE, que têm uma sequência conservada que contém cinco pares de bases (CCGAC), estão em regiões promotoras de muitos genes de Arabidopsis responsivos ao frio, incluindo aqueles designados COR (NOVILLO et al., 2007). Genes CBF são induzidos dentro de, aproximadamente, 15 minutos após a exposição da planta a baixa temperatura (temperaturas inferiores ao ponto de congelamento). Além disso, em cerca de 2 horas, são expressos genes que contêm sequências regulatórias (CRT/DRE), como, por exemplo, o gene CBF-regulon (NOVILLO et al., 2007). A exposição dessas plantas a baixas temperaturas demonstrou que a máxima tolerância foi obtida dentro de duas semanas de exposição. Curiosamente, a atividade de ligação ao DNA de alguns CBFs pode também ser modulada por variação de temperaturas. Em Hordeum vulgare, verificou-se que a afinidade de ligação de CBFs ao elemento CRT/DRE a 0 ºC foi cerca de 10 vezes mais efetiva do que a 25 ºC (NOVILLO et al., 2007). O aumento na tolerância ao frio pelo CBF-regulon tem sido verificado pela sua superexpressão. A expressão constitutiva de genes CBF em Arabidopsis transgênicas resulta na indução da expressão de COR e no aumento da tolerância ao frio, sem que a planta seja exposta a esse fator de estresse (NOVILLO et al., 2007). Isso sugere que múltiplas alterações bioquímicas que estão associadas à aclimatação ao frio e contribuem para o aumento da tolerância a esse estresse, incluindo o acúmulo de açúcares e de prolina, ocorrem em plantas de Arabidopsis não aclimatadas que expressam CBF constitutivamente (NOVILLO et al., 2007). A partir dessas informações, tem sido proposto que genes CBF agem para integrar a ativação de componentes múltiplos da resposta à tolerância ao frio.

Os componentes homólogos de CBF de Arabidopsis em resposta ao frio têm sido encontrados em várias outras espécies de plantas, tais como: canola (Brassica napus), soja (Glycine max), brócolis (Brassica oleracea), tomate (Lycopersicon esculentum), alfalfa (Medicago sativa), tabaco (Nicotiana tabacum), trigo (Triticum aestivumfrom), centeio (Secale cereale), milho (Zea mays), arroz (Oryza sativa), morango (Fragaria ananassa) e cevada (Hordeum vulgare) (NOVILLO et al., 2007).

Para maior compreensão do papel da rede regulatória de tolerância ao frio, estão sendo utilizadas abordagens combinadas de técnicas de bioinformática, genética reversa, obtenção de mutantes em larga escala, análises do transcriptoma, proteoma e metaboloma. Além disso, tem-se focado a interação entre fatores transcricionais e cis-elementos e as diferentes vias de resposta a estresses. Embora, atualmente, seja possível analisar milhares de genes ao mesmo tempo (análise do transcriptoma), a elucidação dos mecanismos de controle transcricionais e metaboloma poderão suprir as lacunas ainda existentes nesse processo complexo.

Superexpressão de genes relacionados à função de membrana em resposta a estresses abióticos

Sob estresses abióticos existem registros das alterações na composição da membrana celular em diversas espécies de plantas. Com raras exceções, são registrados acúmulos específicos de proteínas na membrana. De outro modo, os lipídeos como componentes básicos da membrana celular vêm sendo estudados há vários anos.

Existe grande interesse pela compreensão dos mecanismos que provocam as modificações ocorridas na membrana celular de plantas expostas a estresses por temperaturas subótimas e supraótimas. No entanto, a quantidade de informações relativas à compreensão de mecanismos que levam à tolerância a baixas temperaturas é consideravelmente maior.

A obtenção de mutantes de Arabidopsis tem permitido significante progresso na compreensão dos mecanismos que levam a essas alterações. Mutantes que apresentam composição alterada nos ácidos graxos constituintes da membrana celular estão suprindo as lacunas sobre a via pela qual os ácidos graxos poli-insaturados são gerados (SOMERVILLE; BROWSE, 1991). A clonagem de genes que sofreram mutação por meio do uso de ferramentas da genética molecular tem tornado possível obter informações da estrutura de enzimas na via biossintética dos lipídeos constituintes (SHANKLIN; CAHOON, 1998). A geração de plantas transgênicas pela introdução de genes isolados também tem permitido verificar alterações dos ácidos graxos constituintes de membranas e conduzido à significância fisiológica na tolerância a estresse por temperatura (MURAKAMI et al., 2000; MURATA et al., 1992).

A construção de membranas lipídicas por meio de ferramentas de genética molecular tem permitido à célula vegetal alterar-se transitoriamente de uma fase altamente fluídica (fase de cristal líquido) para uma fase gel sólida, em resposta à redução de temperatura. Essas alterações têm permitido pesquisar a relação entre a composição dos lipídeos constituintes de membrana e a sensibilidade da planta a baixas temperaturas (IBA, 2002). Níveis elevados de ácidos graxos fosfatidil-glicerol (PG) (16:0) em tecidos foliares de plantas sensíveis ao frio foram encontrados; no entanto, esses níveis foram significativamente menores em plantas tolerantes. A fase de cristal líquido dos PGs de plantas sensíveis foi alterada para uma fase de separação a temperaturas de aproximadamente 30 ºC. Por sua vez, PGs de plantas tolerantes atingiram a fase de separação em temperatura de 15 ºC ou menos, o que evidencia uma diferença considerável (MURATA; YAMAYA, 1984). De modo geral, os PGs perfazem de 8% a 10% dos lipídeos cloroplastídicos, e a maioria encontra-se na membrana dos tilacoides. Tem sido constatado que, em plantas tolerantes ao frio, menos de 20% de ácidos graxos saturados estão presentes. No entanto, em plantas sensíveis, os valores são superiores a 40% (KENRICK; BISHOP, 1986; NORMAN et al., 1984; ROUGHAN, 1985).

Experimentos conduzidos utilizando plantas de tabaco transgênicas, com superexpressão de um gene oriundo de abóbora que codifica para glicerol 3-fosfatase acil-transferase foram realizados com o objetivo de clarificar a relação entre a tolerância ao frio e a estrutura molecular do ácido graxo (MURATA et al., 1992). A superexpressão desse gene oriundo de abóbora, uma espécie altamente sensível ao frio, apresentou 76% de ácidos graxos saturados, enquanto plantas do tipo selvagem apresentaram 36%. A superexpressão de um gene oriundo de Arabidopsis para a mesma enzima, ou seja, a partir de uma planta tolerante ao frio, evidenciou que o conteúdo de ácido graxo saturado foi reduzido para 28%. Em outro estudo, Arabidopsis transgênicas superexpressando o gene plsB de E. coli, que codifica para glicerol-3-fosfato-aciltransferase, seletivo para ácido graxo saturado, evidenciam um aumento no conteúdo de ácidos graxos saturados nas membranas de cloroplastos dos transgênicos de aproximadamente 50%, enquanto em plantas do tipo selvagem esse percentual foi de 5%. A sensibilidade dos transgênicos ao frio também foi aumentada (WOLTER et al., 1992). Esses dados sugerem que o nível de saturação dos ácidos graxos constituintes da membrana dos cloroplastos desempenha sua função na sensibilidade de plantas ao estresse por frio.

Análises de Arabidopsis mutantes evidenciam que ácidos graxos poli-insaturados nas membranas dos cloroplastos influenciam no seu tamanho e na sua formação sob estresse por baixa temperatura. O mutante fad5 é deficiente na atividade de um ω-9 ácido graxo desaturase cloroplastídico e acumula altos níveis de ácido palmítico (16:0). De outro modo, um mutante fad6 é deficiente em ω-6 ácido graxo desaturase e acumula níveis elevados de ácidos graxos que contêm apenas uma dupla ligação (16:1 e 18:1). Ambos os mutantes apresentam níveis reduzidos de ácidos graxos poli-insaturados nos cloroplastos. Quando plantas mutantes e selvagens (crescendo a 22 ºC) são submetidas ao estresse por frio (5 ºC) por 3 semanas, as linhagens mutantes mostram claramente mais cloroses do que as do tipo selvagem. A quantidade de clorofila também decresce para aproximadamente a metade quando comparada às do tipo selvagem. Nos mutantes, o conteúdo de membranas do tilacoide decresce, e os cloroplastos são menores (IBA, 2002).

Esses experimentos não apresentam resultados conclusivos a ponto de ser possível a construção de uma planta tolerante a ambientes estressantes. Embora tenha sido constatado que a introdução de um único gene pode resultar em alteração da composição química e física da membrana, levando a planta a respostas diferentes, outros aspectos devem ser levados em consideração. É preciso considerar que, no ambiente onde estão expostas, as plantas podem sofrer mais de um estresse no decorrer do tempo e, muitas vezes, esses estresses ocorrem ao mesmo tempo, o que torna mais complexa a compreensão das suas respostas. Desse modo, os esforços empregados e as ferramentas desenvolvidas recentemente para o estudo dos mecanismos de sinalização e controle genético das respostas de plantas aos estresses abióticos têm permitido progressos significativos; todavia, é consenso que os conhecimentos gerados ultimamente são muito pontuais, e muitos estudos ainda terão de ser efetuados até que tenhamos preenchido as grandes lacunas existentes, para então estarmos aptos a compreender, de forma integral, as respostas das plantas aos estresses abióticos.

Estresse salino

Os mecanismos fisiológicos e moleculares de tolerância a componentes osmóticos e iônicos do estresse salino têm sido revisados em nível celular e na planta inteira. Respostas de plantas à salinidade têm sido evidenciadas para ocorrer sob duas fases: uma rápida, caracterizada pela fase osmótica que inibe o crescimento de folhas jovens, e outra lenta, caracterizada pela fase iônica que acelera a senescência de folhas maduras. A adaptação de plantas para a salinidade ocorre de três formas distintas: pela tolerância a estresses osmóticos, pela exclusão de Na+ ou Cl- e pela tolerância do tecido ao Na+ ou Cl- acumulados (MUNNS; TESTER, 2008). O entendimento a respeito do papel de genes da família HKT na exclusão de Na+ em folhas, bem como a compreensão das bases moleculares para muitos outros processos de transporte em nível celular têm aumentado. Entretanto, ainda é bastante limitada a compreensão molecular do controle global no acúmulo de Na+ e da tolerância ao estresse osmótico na planta inteira, não em uma única célula, como tratam diversos trabalhos. Ferramentas da genética molecular e da genômica funcional oferecem novas oportunidades para avanços mais rápidos e consistentes no que se refere à compreensão fisiológica e molecular, no intuito de auxiliar os programas de melhoramento para obtenção de plantas hábeis no que diz respeito à produção econômica em ambientes inóspitos.

Plantas variam quanto à tolerância à salinidade

As plantas diferem na sua tolerância à salinidade, e isso é evidenciado pelas diferentes respostas de crescimento. Verifica-se que, entre os cereais, o arroz (Oryza sativa) é o mais sensível, e a cevada (Hordeum vulgare) a mais tolerante. A variabilidade na tolerância à salinidade em dicotiledôneas é significativamente maior do que em monocotiledôneas. Algumas leguminosas são muito sensíveis, enquanto a alfafa (Medicago sativa) é mais tolerante. Espécies halófitas, a exemplo de Atriplex spp., desenvolvem-se em ambientes altamente salinos. Várias espécies dicotiledôneas halófitas requerem concentrações elevadas de NaCl (100 mM a 200 mM) para seu crescimento ótimo (FLOWERS et al., 1977). Arabidopsis, quando comparada a outras espécies, sob condições similares de luz e de umidade (sob elevada taxa transpiratória), apresenta-se altamente sensível ao sal. Essa característica da espécie limita a sua utilização em estudos para obtenção de progressos sobre os mecanismos de tolerância à salinidade, se comparada à espécie Thellungiella halophila, relativamente tolerante. As diferenças existentes entre essas duas espécies estão relacionadas às suas respostas a concentrações de 100 mM de NaCl- em condições de transpiração elevada. Exposição continuada a 100 mM não permite que Arabidopsis complete seu ciclo de vida (SICKLER et al., 2007), além de causar pouco efeito sobre o crescimento de Thellungiella (KANT et al., 2006).

Respostas temporais de plantas à salinidade

Para a compreensão dos mecanismos fisiológicos responsáveis pela tolerância à salinidade, é necessário conhecer se o seu crescimento é limitado pelos efeitos osmóticos do sal no solo ou pelos efeitos tóxicos do sal dentro da planta. Em uma análise simples das respostas de plantas ao estresse salino, a redução do crescimento da parte aérea ocorre em duas fases: uma resposta rápida pelo aumento da pressão osmótica externa e uma resposta mais lenta causada pelo acúmulo de Na+ em folhas (Tabela 2).

Tabela 2. Efeitos do estresse salino sobre as plantas.

Efeito do estresse

Estresse osmótico

Estresse causado pela concentração elevada de Na+ nas folhas (estresse iônico)

Velocidade de início

Sítio primário de efeito visível

Rápido

Crescimento reduzido de brotos novos

Lento

Senescência aumentada em folhas velhas

Fonte: adaptado de Munns e Tester (2008).

Inicialmente, na fase osmótica, iniciada imediatamente após a concentração de sal ao redor das raízes ter aumentado para o limiar de resposta, a taxa de crescimento da parte aérea é reduzida significativamente. Esse limiar é de aproximadamente 40 mM de NaCl para a maioria das plantas, ou menos para plantas mais sensíveis, a exemplo de arroz e Arabidopsis. Isso é largamente, mas não inteiramente aceito em virtude do efeito osmótico do sal na superfície das raízes. Sob salinidade elevada ocorre redução da taxa de expansão foliar, novas folhas emergem mais lentamente e gemas laterais se desenvolvem mais lentamente ou permanecem quiescentes.

Em cereais, os maiores efeitos da salinidade sobre a área foliar total ocorrem pela redução no número de ramificações; em dicotiledôneas, os efeitos mais proeminentes ocorrem em virtude da redução do tamanho de folhas individuais ou do número de ramos. Curiosamente, o crescimento da parte aérea é mais sensível do que o crescimento de raízes, um fenômeno que também ocorre durante a secagem do solo e para o qual o mecanismo não está claro. A explicação teleológica é que uma redução relativa no desenvolvimento foliar, se comparado ao crescimento radicular, poderia diminuir o uso de água pela planta, permitindo conservar umidade no solo e prevenir o aumento da concentração de sal no solo.

A segunda fase de resposta da planta à salinidade (íon específico) inicia-se com o acúmulo de sal em concentrações tóxicas em folhas velhas, nas quais o processo de expansão não está mais ocorrendo. Ou seja, o efeito da diluição que ocorre em folhas jovens em expansão não ocorre em folhas velhas, e isso as conduz à senescência. Se a taxa na qual as folhas morrem é maior do que a taxa em que novas folhas são emitidas, a capacidade fotossintética da planta será insuficiente para suprir o requerimento de carboidratos pelas folhas jovens, as quais têm a sua taxa de crescimento reduzida.

O estresse osmótico não apenas afeta imediatamente o crescimento, mas também exerce efeito mais evidente sobre a taxa de crescimento do que o estresse iônico. O estresse iônico influencia o crescimento mais lentamente e com efeito menos pronunciados do que o estresse osmótico, especialmente em níveis moderados de salinidade. Somente em níveis elevados de salinidade, ou em espécies muito sensíveis, as quais não possuem habilidade para controlar o transporte de Na+, os efeitos iônicos sobrepoem os efeitos osmóticos. Em muitas espécies, variações genéticas existem na taxa de acúmulo de Na+ e Cl- em folhas, bem como no grau sob o qual esses íons podem ser tolerados. Um aumento na tolerância para ambos os tipos de estresses poderia habilitar uma planta a crescer a taxas razoavelmente rápidas durante o seu desenvolvimento. Para muitas espécies, Na+ aparece para atingir uma concentração tóxica antes do Cl- e, por essa razão, a maioria dos estudos tem concentrado esforços sobre os mecanismos de exclusão e controle do transporte de Na+ dentro da planta. Entretanto, para algumas espécies, a exemplo da soja, do citros e da videira, o Cl- é considerado o íon mais tóxico (STOREY; WALKER, 1999). As evidências para isso referem-se à associação entre diferenças genéticas na taxa de acúmulo em folhas e a tolerância à salinidade da planta. Essa diferença pode resultar em maior retenção de Na+ em raízes de algumas espécies arbóreas, de modo que pequena quantidade desse íon atinja as folhas; assim K+ torna-se o de maior expressão. Nesse cenário, o Cl-, que continua a ser transportado pela planta, torna o componente mais tóxico na solução salina.

Considerações finais

Os avanços concernentes às ferramentas disponíveis atualmente, tanto para genotipagem quanto para fenotipagem em larga escala, somados à nova ordem mundial, a despeito da grande preocupação com os cenários climáticos futuros, estão redirecionando e reforçando o desenvolvimento de estudos que visam compreender, de forma mais ampla, a interação planta-ambiente. Estudos estão sendo desenvolvidos para o entendimento preciso dos mecanismos moleculares envolvidos nas respostas de plantas a estresses abióticos e em análises detalhadas das redes de sinalização mediada por genes envolvidos nessas respostas. O desenvolvimento de novas técnicas e fontes para a pesquisa, incluindo as “ômicas”, como por exemplo a genômica, proteômica e metabolômica, poderão auxiliar, sobremaneira, na identificação de componentes de sinalização e na caracterização funcional desses componentes envolvidos em vias de transdução de sinal.

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